劉宇鵬+潘龍+鄭小娟+靳魁奇+安珊珊

摘要：采用紫外法測(cè)定發(fā)酵液中的L-赤蘚酮糖。以謝里瓦諾夫（Seliwanoff）試劑為顯色劑，考察了顯色劑用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和顯色穩(wěn)定時(shí)間等因素，確定了優(yōu)化后的試驗(yàn)條件。紫外法的線性范圍為0～1.2 g/L，樣品回收率為101.5%～101.9%，測(cè)定結(jié)果不受發(fā)酵液中底物及菌體自溶物影響，具有快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：L-赤蘚酮糖；Seliwanoff試劑；分光光度法；紫外法測(cè)定

中圖分類號(hào)：TQ920.1；O657.32 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0281-03

L-赤蘚酮糖（L-erythrulose）^[1]是一種自然存在的四碳酮醣，是一種黏稠狀液體，可溶于水，其醛糖形式是L-赤蘚糖，L-赤蘚酮糖可以與皮膚外部或者老死表層中的角蛋白氨基酸（即表皮的角質(zhì)層）發(fā)生反應(yīng)，在化妝品工業(yè)中作為二羥基丙酮^[2]的替代品，解決了大多數(shù)人群對(duì)二羥基丙酮過敏的問題，同時(shí)是多種抗感染藥物的前體化合物^[3]。傳統(tǒng)生產(chǎn)L-赤蘚酮糖的方法是以赤蘚糖醇（meso-erythritol）^[4]為前體的化學(xué)合成法，但此法比較繁瑣，且產(chǎn)物為消旋體手性化合物，拆分困難。微生物轉(zhuǎn)化法通過發(fā)酵過程中的酶促反應(yīng)，可選擇性生成L型產(chǎn)物，且該法操作簡(jiǎn)便，綠色環(huán)保，能夠解決化學(xué)合成法帶來的一系列問題^[5]。因此以赤蘚糖醇作為底物，通過微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-赤蘚酮糖逐漸引起人們的關(guān)注。據(jù)報(bào)道，發(fā)酵液中L-赤蘚酮糖的檢測(cè)方法有HPLC法^[6]、薄層色譜法^[7]和容量分析法^[8]等，其中薄層色譜法只能定性分析，無法精確定量；容量分析法的測(cè)定受發(fā)酵液中其他物質(zhì)的影響，無法精確測(cè)定L-赤蘚酮糖；HPLC法則較為耗時(shí)。據(jù)報(bào)道，在酸性條件下發(fā)酵液中酮糖脫水生成糠醛，后者與謝里瓦諾夫（Seliwanoff）試劑反應(yīng)生成紅色復(fù)合物^[3]。本研究表明，L-赤蘚酮糖在酸性條件下也能與Seliwanoff試劑生成棕紅色復(fù)合物，該復(fù)合物在400 nm處的吸光度與L-赤蘚酮糖濃度的線性關(guān)系良好；而底物赤蘚糖醇在此條件下不干擾測(cè)定。本研究根據(jù)這一原理，建立了紫外法測(cè)定發(fā)酵液中的L-赤蘚酮糖，方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、靈敏。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-1750型紫外-可見光分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司；752N型紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；1515型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司。

L-赤蘚酮糖（美國(guó)Sigma公司）；間苯二酚、濃鹽酸、蛋白胨和磷酸二氫鉀均為分析純；酵母粉為生化試劑；水為蒸餾水。

試驗(yàn)菌種為氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans 1.637），購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：赤蘚糖醇5%，蛋白胨0.5%，酵母粉1%，無水磷酸二氫鉀0.1%，碳酸鈣0.3%，pH值6.8。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制 L-赤蘚酮糖溶液：精確稱取2g L-赤蘚酮糖置于1 000 mL量瓶中，用水定容，制成2g/L的母液，再分別用水稀釋成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L的梯度濃度溶液。

Seliwanoff試劑：稱取2 g間苯二酚溶于330mL濃鹽酸中，加水定容至1 000 mL，完全溶解后密封保存。

1.2.2 紫外法測(cè)定L-赤蘚酮糖 分別量取0.5mL L-赤蘚酮糖系列濃度溶液和4 mL Seliwanoff試劑于比色管中，沸水浴加熱20 min，流水冷卻；以不含L-赤蘚酮糖的溶液為空白參比，測(cè)定樣品的吸光度D400 nm。

發(fā)酵液中L-赤蘚酮糖的測(cè)定：取對(duì)數(shù)期種子液，按5%接種量接入250 mL搖瓶中，裝液量30 mL，調(diào)節(jié)pH值為6.8，于30 ℃振蕩（220 r/min）培養(yǎng)28 h，取1.5 mL發(fā)酵液，離心（3 500 r/min）15 min；取0.5 mL上清液，用水稀釋100倍，取0.5 mL稀釋液，再加入4 mL Seliwanoff試劑，沸水浴加熱 20 min，流水冷卻；以未接種發(fā)酵液為空白參照，于400 nm處測(cè)吸光度D400 nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中L-赤蘚酮糖的含量。

1.2.3 HPLC法測(cè)定L-赤蘚酮糖條件^[6]色譜柱 Agilent Lichrospher5-NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng) 277 nm；流動(dòng)相 乙腈-水（90 ∶10）；柱溫 30 ℃；流速 1 mL/min；進(jìn)樣量 20 μL。

1.2.4 赤蘚糖醇濃度的測(cè)定 用HPLC法^[6]測(cè)定發(fā)酵液中的赤蘚糖醇。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)條件的確定

2.1.1 波長(zhǎng)的測(cè)定 按照“1.2.2”中的方法，以水為空白對(duì)照，掃描不同濃度L-赤蘚酮糖在370～700 nm的吸收光譜。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。保持Seliwanoff試劑濃度不變，僅改變L-赤蘚酮糖的濃度（0.1～1.2 g/L），所得系列吸收光譜見圖1。由圖1可以看出，在400 nm波長(zhǎng)處反應(yīng)溶液有最大吸收，且吸光度的增加與L-赤蘚酮糖溶液濃度的增加成正比。最終選擇測(cè)定波長(zhǎng)為400 nm。

3 結(jié)論

本研究建立了紫外法測(cè)定以赤蘚糖醇為底物的發(fā)酵液中的L-赤蘚酮糖。結(jié)果顯示，L-赤蘚酮糖濃度超過1.2 g/L后D400 nm大于0.6，因此擬定本法的線性范圍為0.1～1.2 g/L。配制Seliwanoff試劑的溶劑為濃鹽酸與間苯二酚，易揮發(fā)，加熱過程中要注意保持密封。經(jīng)對(duì)比試驗(yàn)，HPLC法和紫外法的測(cè)量誤差在2%以內(nèi)，且本法不受發(fā)酵液中赤蘚糖醇和可溶性蛋白的影響，顯色穩(wěn)定，測(cè)量快速準(zhǔn)確，適合用于微生物發(fā)酵法制備L-赤蘚酮糖工藝中的產(chǎn)物測(cè)定。

參考文獻(xiàn)：

[1]Bongs J，Hahn D，Schrken U，et al. Continuous production of erythrulose using transketolase in a membrane reactor[J]. Biotechnology Letters，1997，19（3）：213-216.

[2]Douschan K. Process for the biotechnological preparation of L-erythrulose：WO，01/42483 A1[P].2011-06-14.

[3]張惟杰. 糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M]. 杭州：浙江大學(xué)出版社，1999：540.

[4]張永勤，薛長(zhǎng)湖，湯浩源，等. 還原糖的可見分光光度法研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（5）：97-99，104.

[5]Sprenger G A，Schrken U，Sprenger G，et al.Transketolase a of Escherichia coli K12[J]. European Journal of Biochemistry，1995，230（2）：525-532.

[6]葛馳宇，張君麗，陳建華. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中赤蘚糖醇和L-赤蘚酮糖的含量[J]. 色譜，2012，30（8）：843-846.

[7]張永勤，王哲平，宋雨梅，等. 還原糖測(cè)定方法的比較研究[J]. 食品工業(yè)科技，2010，31（6）：321-323，326.

[8]魏 群. 基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 3版.北京：高等教育出版社，2009：81-82.

[9]劉宇鵬，李 華，孫 楊，等. 發(fā)酵液中1，3-二羥基丙酮的分光光度法測(cè)定[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2011，42（11）：834-837.endprint

摘要：采用紫外法測(cè)定發(fā)酵液中的L-赤蘚酮糖。以謝里瓦諾夫（Seliwanoff）試劑為顯色劑，考察了顯色劑用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和顯色穩(wěn)定時(shí)間等因素，確定了優(yōu)化后的試驗(yàn)條件。紫外法的線性范圍為0～1.2 g/L，樣品回收率為101.5%～101.9%，測(cè)定結(jié)果不受發(fā)酵液中底物及菌體自溶物影響，具有快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：L-赤蘚酮糖；Seliwanoff試劑；分光光度法；紫外法測(cè)定

中圖分類號(hào)：TQ920.1；O657.32 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0281-03

L-赤蘚酮糖（L-erythrulose）^[1]是一種自然存在的四碳酮醣，是一種黏稠狀液體，可溶于水，其醛糖形式是L-赤蘚糖，L-赤蘚酮糖可以與皮膚外部或者老死表層中的角蛋白氨基酸（即表皮的角質(zhì)層）發(fā)生反應(yīng)，在化妝品工業(yè)中作為二羥基丙酮^[2]的替代品，解決了大多數(shù)人群對(duì)二羥基丙酮過敏的問題，同時(shí)是多種抗感染藥物的前體化合物^[3]。傳統(tǒng)生產(chǎn)L-赤蘚酮糖的方法是以赤蘚糖醇（meso-erythritol）^[4]為前體的化學(xué)合成法，但此法比較繁瑣，且產(chǎn)物為消旋體手性化合物，拆分困難。微生物轉(zhuǎn)化法通過發(fā)酵過程中的酶促反應(yīng)，可選擇性生成L型產(chǎn)物，且該法操作簡(jiǎn)便，綠色環(huán)保，能夠解決化學(xué)合成法帶來的一系列問題^[5]。因此以赤蘚糖醇作為底物，通過微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-赤蘚酮糖逐漸引起人們的關(guān)注。據(jù)報(bào)道，發(fā)酵液中L-赤蘚酮糖的檢測(cè)方法有HPLC法^[6]、薄層色譜法^[7]和容量分析法^[8]等，其中薄層色譜法只能定性分析，無法精確定量；容量分析法的測(cè)定受發(fā)酵液中其他物質(zhì)的影響，無法精確測(cè)定L-赤蘚酮糖；HPLC法則較為耗時(shí)。據(jù)報(bào)道，在酸性條件下發(fā)酵液中酮糖脫水生成糠醛，后者與謝里瓦諾夫（Seliwanoff）試劑反應(yīng)生成紅色復(fù)合物^[3]。本研究表明，L-赤蘚酮糖在酸性條件下也能與Seliwanoff試劑生成棕紅色復(fù)合物，該復(fù)合物在400 nm處的吸光度與L-赤蘚酮糖濃度的線性關(guān)系良好；而底物赤蘚糖醇在此條件下不干擾測(cè)定。本研究根據(jù)這一原理，建立了紫外法測(cè)定發(fā)酵液中的L-赤蘚酮糖，方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、靈敏。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-1750型紫外-可見光分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司；752N型紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；1515型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司。

L-赤蘚酮糖（美國(guó)Sigma公司）；間苯二酚、濃鹽酸、蛋白胨和磷酸二氫鉀均為分析純；酵母粉為生化試劑；水為蒸餾水。

試驗(yàn)菌種為氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans 1.637），購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：赤蘚糖醇5%，蛋白胨0.5%，酵母粉1%，無水磷酸二氫鉀0.1%，碳酸鈣0.3%，pH值6.8。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制 L-赤蘚酮糖溶液：精確稱取2g L-赤蘚酮糖置于1 000 mL量瓶中，用水定容，制成2g/L的母液，再分別用水稀釋成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L的梯度濃度溶液。

Seliwanoff試劑：稱取2 g間苯二酚溶于330mL濃鹽酸中，加水定容至1 000 mL，完全溶解后密封保存。

1.2.2 紫外法測(cè)定L-赤蘚酮糖 分別量取0.5mL L-赤蘚酮糖系列濃度溶液和4 mL Seliwanoff試劑于比色管中，沸水浴加熱20 min，流水冷卻；以不含L-赤蘚酮糖的溶液為空白參比，測(cè)定樣品的吸光度D400 nm。

發(fā)酵液中L-赤蘚酮糖的測(cè)定：取對(duì)數(shù)期種子液，按5%接種量接入250 mL搖瓶中，裝液量30 mL，調(diào)節(jié)pH值為6.8，于30 ℃振蕩（220 r/min）培養(yǎng)28 h，取1.5 mL發(fā)酵液，離心（3 500 r/min）15 min；取0.5 mL上清液，用水稀釋100倍，取0.5 mL稀釋液，再加入4 mL Seliwanoff試劑，沸水浴加熱 20 min，流水冷卻；以未接種發(fā)酵液為空白參照，于400 nm處測(cè)吸光度D400 nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中L-赤蘚酮糖的含量。

1.2.3 HPLC法測(cè)定L-赤蘚酮糖條件^[6]色譜柱 Agilent Lichrospher5-NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng) 277 nm；流動(dòng)相 乙腈-水（90 ∶10）；柱溫 30 ℃；流速 1 mL/min；進(jìn)樣量 20 μL。

1.2.4 赤蘚糖醇濃度的測(cè)定 用HPLC法^[6]測(cè)定發(fā)酵液中的赤蘚糖醇。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)條件的確定

2.1.1 波長(zhǎng)的測(cè)定 按照“1.2.2”中的方法，以水為空白對(duì)照，掃描不同濃度L-赤蘚酮糖在370～700 nm的吸收光譜。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。保持Seliwanoff試劑濃度不變，僅改變L-赤蘚酮糖的濃度（0.1～1.2 g/L），所得系列吸收光譜見圖1。由圖1可以看出，在400 nm波長(zhǎng)處反應(yīng)溶液有最大吸收，且吸光度的增加與L-赤蘚酮糖溶液濃度的增加成正比。最終選擇測(cè)定波長(zhǎng)為400 nm。

3 結(jié)論

本研究建立了紫外法測(cè)定以赤蘚糖醇為底物的發(fā)酵液中的L-赤蘚酮糖。結(jié)果顯示，L-赤蘚酮糖濃度超過1.2 g/L后D400 nm大于0.6，因此擬定本法的線性范圍為0.1～1.2 g/L。配制Seliwanoff試劑的溶劑為濃鹽酸與間苯二酚，易揮發(fā)，加熱過程中要注意保持密封。經(jīng)對(duì)比試驗(yàn)，HPLC法和紫外法的測(cè)量誤差在2%以內(nèi)，且本法不受發(fā)酵液中赤蘚糖醇和可溶性蛋白的影響，顯色穩(wěn)定，測(cè)量快速準(zhǔn)確，適合用于微生物發(fā)酵法制備L-赤蘚酮糖工藝中的產(chǎn)物測(cè)定。

參考文獻(xiàn)：

[1]Bongs J，Hahn D，Schrken U，et al. Continuous production of erythrulose using transketolase in a membrane reactor[J]. Biotechnology Letters，1997，19（3）：213-216.

[2]Douschan K. Process for the biotechnological preparation of L-erythrulose：WO，01/42483 A1[P].2011-06-14.

[3]張惟杰. 糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M]. 杭州：浙江大學(xué)出版社，1999：540.

[4]張永勤，薛長(zhǎng)湖，湯浩源，等. 還原糖的可見分光光度法研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（5）：97-99，104.

[5]Sprenger G A，Schrken U，Sprenger G，et al.Transketolase a of Escherichia coli K12[J]. European Journal of Biochemistry，1995，230（2）：525-532.

[6]葛馳宇，張君麗，陳建華. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中赤蘚糖醇和L-赤蘚酮糖的含量[J]. 色譜，2012，30（8）：843-846.

[7]張永勤，王哲平，宋雨梅，等. 還原糖測(cè)定方法的比較研究[J]. 食品工業(yè)科技，2010，31（6）：321-323，326.

[8]魏 群. 基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 3版.北京：高等教育出版社，2009：81-82.

[9]劉宇鵬，李 華，孫 楊，等. 發(fā)酵液中1，3-二羥基丙酮的分光光度法測(cè)定[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2011，42（11）：834-837.endprint

摘要：采用紫外法測(cè)定發(fā)酵液中的L-赤蘚酮糖。以謝里瓦諾夫（Seliwanoff）試劑為顯色劑，考察了顯色劑用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和顯色穩(wěn)定時(shí)間等因素，確定了優(yōu)化后的試驗(yàn)條件。紫外法的線性范圍為0～1.2 g/L，樣品回收率為101.5%～101.9%，測(cè)定結(jié)果不受發(fā)酵液中底物及菌體自溶物影響，具有快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：L-赤蘚酮糖；Seliwanoff試劑；分光光度法；紫外法測(cè)定

中圖分類號(hào)：TQ920.1；O657.32 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0281-03

L-赤蘚酮糖（L-erythrulose）^[1]是一種自然存在的四碳酮醣，是一種黏稠狀液體，可溶于水，其醛糖形式是L-赤蘚糖，L-赤蘚酮糖可以與皮膚外部或者老死表層中的角蛋白氨基酸（即表皮的角質(zhì)層）發(fā)生反應(yīng)，在化妝品工業(yè)中作為二羥基丙酮^[2]的替代品，解決了大多數(shù)人群對(duì)二羥基丙酮過敏的問題，同時(shí)是多種抗感染藥物的前體化合物^[3]。傳統(tǒng)生產(chǎn)L-赤蘚酮糖的方法是以赤蘚糖醇（meso-erythritol）^[4]為前體的化學(xué)合成法，但此法比較繁瑣，且產(chǎn)物為消旋體手性化合物，拆分困難。微生物轉(zhuǎn)化法通過發(fā)酵過程中的酶促反應(yīng)，可選擇性生成L型產(chǎn)物，且該法操作簡(jiǎn)便，綠色環(huán)保，能夠解決化學(xué)合成法帶來的一系列問題^[5]。因此以赤蘚糖醇作為底物，通過微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-赤蘚酮糖逐漸引起人們的關(guān)注。據(jù)報(bào)道，發(fā)酵液中L-赤蘚酮糖的檢測(cè)方法有HPLC法^[6]、薄層色譜法^[7]和容量分析法^[8]等，其中薄層色譜法只能定性分析，無法精確定量；容量分析法的測(cè)定受發(fā)酵液中其他物質(zhì)的影響，無法精確測(cè)定L-赤蘚酮糖；HPLC法則較為耗時(shí)。據(jù)報(bào)道，在酸性條件下發(fā)酵液中酮糖脫水生成糠醛，后者與謝里瓦諾夫（Seliwanoff）試劑反應(yīng)生成紅色復(fù)合物^[3]。本研究表明，L-赤蘚酮糖在酸性條件下也能與Seliwanoff試劑生成棕紅色復(fù)合物，該復(fù)合物在400 nm處的吸光度與L-赤蘚酮糖濃度的線性關(guān)系良好；而底物赤蘚糖醇在此條件下不干擾測(cè)定。本研究根據(jù)這一原理，建立了紫外法測(cè)定發(fā)酵液中的L-赤蘚酮糖，方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、靈敏。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-1750型紫外-可見光分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司；752N型紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；1515型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司。

L-赤蘚酮糖（美國(guó)Sigma公司）；間苯二酚、濃鹽酸、蛋白胨和磷酸二氫鉀均為分析純；酵母粉為生化試劑；水為蒸餾水。

試驗(yàn)菌種為氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans 1.637），購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：赤蘚糖醇5%，蛋白胨0.5%，酵母粉1%，無水磷酸二氫鉀0.1%，碳酸鈣0.3%，pH值6.8。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制 L-赤蘚酮糖溶液：精確稱取2g L-赤蘚酮糖置于1 000 mL量瓶中，用水定容，制成2g/L的母液，再分別用水稀釋成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L的梯度濃度溶液。

Seliwanoff試劑：稱取2 g間苯二酚溶于330mL濃鹽酸中，加水定容至1 000 mL，完全溶解后密封保存。

1.2.2 紫外法測(cè)定L-赤蘚酮糖 分別量取0.5mL L-赤蘚酮糖系列濃度溶液和4 mL Seliwanoff試劑于比色管中，沸水浴加熱20 min，流水冷卻；以不含L-赤蘚酮糖的溶液為空白參比，測(cè)定樣品的吸光度D400 nm。

發(fā)酵液中L-赤蘚酮糖的測(cè)定：取對(duì)數(shù)期種子液，按5%接種量接入250 mL搖瓶中，裝液量30 mL，調(diào)節(jié)pH值為6.8，于30 ℃振蕩（220 r/min）培養(yǎng)28 h，取1.5 mL發(fā)酵液，離心（3 500 r/min）15 min；取0.5 mL上清液，用水稀釋100倍，取0.5 mL稀釋液，再加入4 mL Seliwanoff試劑，沸水浴加熱 20 min，流水冷卻；以未接種發(fā)酵液為空白參照，于400 nm處測(cè)吸光度D400 nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中L-赤蘚酮糖的含量。

1.2.3 HPLC法測(cè)定L-赤蘚酮糖條件^[6]色譜柱 Agilent Lichrospher5-NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng) 277 nm；流動(dòng)相 乙腈-水（90 ∶10）；柱溫 30 ℃；流速 1 mL/min；進(jìn)樣量 20 μL。

1.2.4 赤蘚糖醇濃度的測(cè)定 用HPLC法^[6]測(cè)定發(fā)酵液中的赤蘚糖醇。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)條件的確定

2.1.1 波長(zhǎng)的測(cè)定 按照“1.2.2”中的方法，以水為空白對(duì)照，掃描不同濃度L-赤蘚酮糖在370～700 nm的吸收光譜。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。保持Seliwanoff試劑濃度不變，僅改變L-赤蘚酮糖的濃度（0.1～1.2 g/L），所得系列吸收光譜見圖1。由圖1可以看出，在400 nm波長(zhǎng)處反應(yīng)溶液有最大吸收，且吸光度的增加與L-赤蘚酮糖溶液濃度的增加成正比。最終選擇測(cè)定波長(zhǎng)為400 nm。

3 結(jié)論

本研究建立了紫外法測(cè)定以赤蘚糖醇為底物的發(fā)酵液中的L-赤蘚酮糖。結(jié)果顯示，L-赤蘚酮糖濃度超過1.2 g/L后D400 nm大于0.6，因此擬定本法的線性范圍為0.1～1.2 g/L。配制Seliwanoff試劑的溶劑為濃鹽酸與間苯二酚，易揮發(fā)，加熱過程中要注意保持密封。經(jīng)對(duì)比試驗(yàn)，HPLC法和紫外法的測(cè)量誤差在2%以內(nèi)，且本法不受發(fā)酵液中赤蘚糖醇和可溶性蛋白的影響，顯色穩(wěn)定，測(cè)量快速準(zhǔn)確，適合用于微生物發(fā)酵法制備L-赤蘚酮糖工藝中的產(chǎn)物測(cè)定。

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