孫海燕+羅兵

摘要：介紹了一種新的擴(kuò)增大片段cDNA序列的方法。采用RT-PCR和基因組PCR相結(jié)合的方法，分段擴(kuò)增基因的編碼區(qū)，然后再通過(guò)重疊延伸PCR拼接出基因的全長(zhǎng)序列。雖然在確定基因表達(dá)的前提下，也可不通過(guò) RT-PCR，直接利用基因組PCR和重疊延伸PCR相結(jié)合的方法獲得靶基因的全長(zhǎng)，但是利用重疊延伸PCR克隆大片段cDNA原理更簡(jiǎn)單，效率更高，價(jià)格更低，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：水稻；大片段cDNA；重疊延伸PCR

中圖分類號(hào)：S511.2+20.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0051-02

分離和克隆基因是研究基因功能的基礎(chǔ)。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)編碼基因，通常是通過(guò)RT-PCR的方法，獲得基因全長(zhǎng)。但是，某些基因由于片段過(guò)長(zhǎng)，在RT-PCR過(guò)程中，可能由于mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)或反轉(zhuǎn)錄酶延伸效率的影響，難以獲得cDNA全長(zhǎng)^[1-3]。在本研究中，以水稻的UDP-N-乙酰葡萄糖胺?；D(zhuǎn)移酶基因（OsLpxA）為例，詳細(xì)介紹一種新的擴(kuò)增大片段cDNA序列的方法。水稻OsLpxA基因的cDNA總長(zhǎng)度為7 181 bp，采用RT-PCR和基因組PCR相結(jié)合的方法，先分段擴(kuò)增基因的編碼區(qū)，然后通過(guò)重疊延伸PCR將各片段連接起來(lái)，獲得基因的全長(zhǎng)序列^[4-5]。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，利用重疊延伸PCR克隆靶基因是一種實(shí)用且高效的獲得大片段cDNA的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 水稻材料 粳稻（Oryza sativa L. Subsp. japonica）品種為日本晴，由常熟市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。取樣部位為孕穗期的小穗，樣品保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.1.2 質(zhì)粒、菌株和試劑。大腸桿菌DH5α由常熟理工·端木銀熙水稻育種中心保存；質(zhì)粒pCAMBIA1300由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)能實(shí)驗(yàn)室提供；反轉(zhuǎn)錄酶、cDNA合成試劑盒和其他分子生物學(xué)試劑均購(gòu)自寶生物工程大連有限公司；引物由上海生工生物公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水稻OsLpxA基因的分段克隆 根據(jù)網(wǎng)站http：//rice.plantbiology.msu.edu/公布的水稻基因組序列，OsLpxA基因一共由8 687個(gè)堿基對(duì)組成，包括7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子（圖1）。按照模板鏈從5′到3′的順序，7個(gè)外顯子的長(zhǎng)度分別為202 bp、140 bp、441 bp、360 bp、179 bp、3 270 bp和2 589 bp，cDNA總長(zhǎng)度為7 181 bp。由于cDNA比較大，不容易通過(guò)RT-PCR獲得全長(zhǎng)，因此采用分段合成的方法，然后再通過(guò)重疊延伸PCR獲得OsLpxA基因的全長(zhǎng)。分段克隆的具體方案如下：（1）F1片段的克隆。OsLpxA基因的前5個(gè)外顯子都比較小，總長(zhǎng)在1 322 bp，我們將這5個(gè)外顯子組成的 cDNA 序列定義為F1片段，由于F1片段位于基因的5′端，容易通過(guò)RT-PCR獲得。以mRNA為模板，以1S和1A為引物，經(jīng)RT-PCR合成得到F1片段。（2）F2片段的克隆。第6個(gè)外顯子全長(zhǎng)3 270 bp，定義為F2片段。直接以基因組DNA為模板，以2S和2A為引物，通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增，得到F2片段。（3）F3片段的克隆。第7個(gè)外顯子全長(zhǎng)2 589 bp，定義為F3片段。以基因組DNA為模板，以3S和3A為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增，得到F3片段。3對(duì)引物在基因上的具體位置如圖1。

1.2.2 水稻OsLpxA基因全長(zhǎng)的拼接 通過(guò)重疊延伸PCR將F1片段、F2片段和F3片段連接起來(lái)。具體方案如下：（1）設(shè)計(jì)引物：3對(duì)引物1S和O1A、O2S和O2A、O3S和3A在片段中的具體位置如圖2，引物O1A和O2S各包含F(xiàn)1片段3′端后12個(gè)堿基和F2片段5′端前12個(gè)堿基，引物O2A和O3S各包含F(xiàn)2片段3′端后12個(gè)堿基和F3片段5′端前12個(gè)堿基。（2）PCR擴(kuò)增：分別以1S和O1A、O2S和O2A、O3S和3A為引物，以F1片段、F2片段和F3片段為模板，PCR擴(kuò)增得到F4片段、F5片段和F6片段。由于F4片段的3′端和F5片段的5′端、F5片段的3′端和F6片段的5′端各具有相互重疊的一段序列，可以通過(guò)重疊延伸PCR拼接出基因全長(zhǎng)。以1S和3A為引物，以F4、F5和F6片段的混合物為模板，通過(guò)重疊延伸PCR，獲得OsLpxA基因全長(zhǎng)（圖2）。

1.2.3 全長(zhǎng)OsLpxA基因的克隆與測(cè)序 基因全長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物用XbaⅠ酶切后，與經(jīng)XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切的載體相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 F1片段的克隆

取液氮保存的水稻幼穗提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 為模板，以1S和1A為引物，PCR擴(kuò)增出的F1片段長(zhǎng)度為1 322 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖3-A）。

2.2 F2和F3片段的克隆

以水稻基因組DNA為模板，分別以2S和2A、3S和3A為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出，獲得F2和F3片段的長(zhǎng)度分別為 3 270 bp （圖3-B）和2 568 bp（圖3-C），與預(yù)期結(jié)果相符。

2.3 水稻OsLpxA的cDNA全長(zhǎng)的克隆

分別以F1、F2和F3片段為模板，以1S和O1A、O2S和O2A、O3S和3A為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后，將得到的3種PCR產(chǎn)物混合為模板，以1S和3A為引物，通過(guò)重疊延伸PCR擴(kuò)增出7 181 bp的片段（圖3-D），該片段大小與預(yù)期結(jié)果相符。通過(guò)對(duì)獲得的長(zhǎng)片段進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)有99.9%的堿基與已知基因相同，表明該序列為OsLpxA基因。

3 討論

對(duì)已知堿基序列基因的克隆，通常的做法是將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過(guò)常規(guī)PCR一次性獲得基因的全長(zhǎng)。作者曾反復(fù)試驗(yàn)，利用1S和3A兩個(gè)端頭引物，以mRNA為模板，欲經(jīng)RT-PCR直接獲得OsLpxA基因的全長(zhǎng)，但是沒(méi)有成功?？赡艿脑蛴校海?）mRNA存在復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)，使反轉(zhuǎn)錄脫落^[1-3]。

本研究采用RT-PCR和基因組PCR相結(jié)合的方法，分段克隆基因，再通過(guò)重疊延伸PCR，獲得基因的全長(zhǎng)。這種方法較好地解決了因基因過(guò)大難以獲得全長(zhǎng)的問(wèn)題，大大提高了大片段cDNA克隆的成功效率。此外，在確定基因表達(dá)的前提下，也可不通過(guò)RT-PCR，直接利用基因組PCR和重疊延伸PCR相結(jié)合的方法，獲得靶基因的全長(zhǎng)。

本研究表明，利用重疊延伸PCR克隆大片段cDNA，幾乎可用于任何已知序列基因的全長(zhǎng)cDNA克隆。因此，本方法在重組DNA領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]Fan X，Xu Y，Bisceglie A M. Efficient amplification and cloning of near full-length hepatitis C virus genome from clinical samples[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，346（4）：1163-1172.

[2]Sahdev S，Saini S，Tiwari P，et al. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design，enhancers and modified PCR cycle conditions[J]. Molecular and Cellular Probes，2007，21（4）：303-307.

[3]Spiess A N，Lvell R. A highly efficient method for long-chain cDNA synthesis using trehalose and betaine[J]. Analytical Biochemistry，2002，301（2）：168-174.

[4]Bryksin A V，Matsumura I. Overlap extension PCR cloning：a simple and reliable way to create recombinant plasmids[J]. BioTechniques，2010，48（6）：463-465.

[5]蘇 燕，邵 國(guó)，高嵩單，等. 一種簡(jiǎn)便高效利用重疊延伸PCR進(jìn)行基因定點(diǎn)突變的方法[J]. 包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，23（6）：559-560.

對(duì)已知堿基序列基因的克隆，通常的做法是將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過(guò)常規(guī)PCR一次性獲得基因的全長(zhǎng)。作者曾反復(fù)試驗(yàn)，利用1S和3A兩個(gè)端頭引物，以mRNA為模板，欲經(jīng)RT-PCR直接獲得OsLpxA基因的全長(zhǎng)，但是沒(méi)有成功?？赡艿脑蛴校海?）mRNA存在復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)，使反轉(zhuǎn)錄脫落^[1-3]。

本研究采用RT-PCR和基因組PCR相結(jié)合的方法，分段克隆基因，再通過(guò)重疊延伸PCR，獲得基因的全長(zhǎng)。這種方法較好地解決了因基因過(guò)大難以獲得全長(zhǎng)的問(wèn)題，大大提高了大片段cDNA克隆的成功效率。此外，在確定基因表達(dá)的前提下，也可不通過(guò)RT-PCR，直接利用基因組PCR和重疊延伸PCR相結(jié)合的方法，獲得靶基因的全長(zhǎng)。

本研究表明，利用重疊延伸PCR克隆大片段cDNA，幾乎可用于任何已知序列基因的全長(zhǎng)cDNA克隆。因此，本方法在重組DNA領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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[5]蘇 燕，邵 國(guó)，高嵩單，等. 一種簡(jiǎn)便高效利用重疊延伸PCR進(jìn)行基因定點(diǎn)突變的方法[J]. 包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，23（6）：559-560.

對(duì)已知堿基序列基因的克隆，通常的做法是將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過(guò)常規(guī)PCR一次性獲得基因的全長(zhǎng)。作者曾反復(fù)試驗(yàn)，利用1S和3A兩個(gè)端頭引物，以mRNA為模板，欲經(jīng)RT-PCR直接獲得OsLpxA基因的全長(zhǎng)，但是沒(méi)有成功?？赡艿脑蛴校海?）mRNA存在復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)，使反轉(zhuǎn)錄脫落^[1-3]。

本研究采用RT-PCR和基因組PCR相結(jié)合的方法，分段克隆基因，再通過(guò)重疊延伸PCR，獲得基因的全長(zhǎng)。這種方法較好地解決了因基因過(guò)大難以獲得全長(zhǎng)的問(wèn)題，大大提高了大片段cDNA克隆的成功效率。此外，在確定基因表達(dá)的前提下，也可不通過(guò)RT-PCR，直接利用基因組PCR和重疊延伸PCR相結(jié)合的方法，獲得靶基因的全長(zhǎng)。

本研究表明，利用重疊延伸PCR克隆大片段cDNA，幾乎可用于任何已知序列基因的全長(zhǎng)cDNA克隆。因此，本方法在重組DNA領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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