鄭舒文+田有亮+白玉娥+何炎紅

摘要：以沙地云杉葉基因組DNA為材料，采用單因素試驗方法對ISSR-PCR體系中的主要成分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物濃度、退火溫度進行篩選，建立并優(yōu)化沙地ISSR-PCR反應(yīng)體系。結(jié)果表明，UBC835是最適引物，適宜退火溫度為50 ℃。沙地云杉ISSR-PCR分析的最適反應(yīng)體系（20 μL PCR反應(yīng)體系）為：2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、0.25 μmol/L引物、50 ng/μL模板DNA。PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

關(guān)鍵詞：沙地云杉；葉基因組DNA；ISSR-PCR；優(yōu)化

中圖分類號：S791.180.1 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0048-03

沙地云杉（Picea mongolica）是中國稀有珍貴樹種，集中成片地分布在生態(tài)環(huán)境惡劣的內(nèi)蒙古自治區(qū)以克什克騰旗的白音敖包自然保護區(qū)，形成了罕見的沙地森林。沙地云杉具有耐旱抗寒、防風阻沙、調(diào)節(jié)氣候等特點，并且生存年代久遠，所以被稱為沙漠上的“綠寶石”和“生物活化石”^[1]。自引種到遼寧、北京、呼和浩特成功之后^[2]，沙地云杉不再是內(nèi)蒙古草原的特有樹種。目前，沙地云杉的研究仍停滯在生態(tài)學水平，對其遺傳多樣性的研究尚未見報道。

簡單重復序列間區(qū)標記技術(shù)（inter-simple sequence repeat，ISSR）是由加拿大蒙特利爾大學的Zietkiewicz等于1994年發(fā)展起來的一種微衛(wèi)星的分子標記^[3]。ISSR標記呈孟德爾式遺傳，大部分ISSR標記為顯性標記。它結(jié)合了SSR和RAPD的優(yōu)點^[4]，具有模板 DNA用量少、質(zhì)量要求低，擴增產(chǎn)物特異性強，重復性高，試驗操作簡便，費用較低等特點，又比RFLP、RAPD、SSR能更多地提供遺傳信息，已被廣泛應(yīng)用于品種鑒定、遺傳多樣性、系統(tǒng)進化關(guān)系、遺傳作圖、基因定位、標記輔助選擇^[5]等研究，通過遺傳多樣性手段對沙地云杉作進一步研究。本試驗以沙地云杉葉基因組為模板DNA，分析引物、dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶濃度、退火溫度對ISSR-PCR擴增的影響，建立適合沙地云杉ISSR-PCR的反應(yīng)體系，為研究沙地云杉的系統(tǒng)進化、物種鑒定和種間雜交育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 試驗材料來自內(nèi)蒙古渾善達克沙地，種子于40 ℃烘箱中烘干后取出，浸于75%甲醇中一段時間，然后放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將長出的嫩葉放入-80 ℃保存，以備取用。

1.1.2 試劑 提取基因組DNA：CTAB提取液，β-巰基乙醇，1×TE緩沖液。引物參照哥倫比亞大學（University of British Columbia，UBC）公布的ISSR引物序列，由北京華大基因有限公司合成。本試驗反應(yīng)體系優(yōu)化試驗固定引物UBC 835的序列為：AGAGAGAGAGAGAGAGC。用于ISSR-PCR的試劑：dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer、DNA Marker（DL2000）購自天根（TIANGEN）生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 本試驗采用CTAB法提取沙地云杉基因組DNA。

1.2.2 DNA濃度及純度檢測 用紫外分光光度計測定DNA樣品在260 nm和280 nm處的吸光度，檢測其濃度和純度。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量并進行PCR擴增，最后稀釋至50 ng/μL保存在-20 ℃中備用。

1.2.3 PCR單因素試驗 單因素試驗是其他因子保持不變，其中1個因子按照一定濃度梯度變化，從而篩選出各因子適合繼續(xù)優(yōu)化的最適濃度。本試驗是為了篩選出適合于沙地云杉ISSR-PCR反應(yīng)體系的各因素最佳濃度。不同因素濃度水平見表1。

1.2.4 PCR反應(yīng)條件 94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，UBC 835的退火溫度是50 ℃，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40個循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 擴增產(chǎn)物檢測 1.2%的瓊脂糖凝膠在0.5 ×TBE緩沖液中電泳檢測，用UVP凝膠成像系統(tǒng)照相保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物濃度的優(yōu)化

引物濃度是影響PCR結(jié)果的重要變量之一。濃度過低阻礙引物與模板DNA的結(jié)合，不能產(chǎn)生有效擴增條帶。濃度過高會引起非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體等的形成^[6]，使目的DNA片段擴增量下降，條帶不清晰。由圖1可見，濃度為0.15 μmol/L時，擴增條帶較弱，不清晰；0.20、0.30 μmol/L 條帶比0.15 μmol/L清晰，但有彌散現(xiàn)象，不是很穩(wěn)定，所以20 μL反應(yīng)體積中確定條帶穩(wěn)定的 0.25 μmol/L 為最適引物濃度。

2.2 Mg2+濃度的優(yōu)化

Mg2+濃度對PCR擴增的特異性和產(chǎn)物有顯著的影響，Mg2+作為Taq DNA 聚合酶的依賴性因子，不僅影響Taq酶的活性，反應(yīng)體系中的dNTPs、模板DNA及引物都會與Mg2+結(jié)合^[7]。Mg2+濃度過高反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增；濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。由圖2可知， 4個Mg2+濃度， 即2.0、1.0、1.5、2.5 mmol/L條件下均有擴增產(chǎn)物，但是Mg2+濃度在1.0、1.5 mmol/L時，條帶較少；濃度在2.5 mmol/L時出現(xiàn)非特異性擴增，濃度在 2.0 mmol/L 時條帶清晰，穩(wěn)定性高。所以Mg2+用量為 2.0 mmol/L 是最佳濃度。

2.3 Taq DNA聚合酶的優(yōu)化

Taq DNA聚合酶的用量是影響擴增的重要因素，濃度過低會使酶過早地消耗完造成合成效率下降，濃度過高容易產(chǎn)生非特異性擴增且增加成本。從圖3可見，不同Taq DNA聚合酶濃度從0.5、1.0、1.5、2.0 U/μL均有擴增產(chǎn)物，濃度在0.5 U/μL條帶相對較弱，1.0、1.5、2.0 U/μL時擴增出的條帶無顯著差異，考慮穩(wěn)定性和成本，而且1.5 U/μL的條帶亮度高和穩(wěn)定性強。最終確定Taq DNA聚合酶用量為1.0 U/μL。

2.4 dNTPs濃度的優(yōu)化

dNTPs濃度與PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTPs能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。濃度高會導致片段缺失，而濃度太低又會導致擴增產(chǎn)率下降^[4]。從圖4中可見，dNTPs濃度為0.15、0.20、 0.25、0.30 mmol/L均有擴增條帶，dNTPs濃度為0.15、0.30 mmol/L時，擴增出的條帶較少；在0.20、0.25 mmol/L時擴增條帶較多，但0.25 mmol/L比0.20 mmol/L 條帶清晰。因此確定dNTPs濃度為0.25 mmol/L。

2.5 退火溫度的優(yōu)化

為了確定引物的最適退火溫度，參照所選引物序列計算理論退火溫度Tm，Tm=4（G+C）+2（A+T）^[8]。溫度低于Tm值，擴增產(chǎn)物特異性降低，擴增出來的條帶較弱；溫度過高不利于引物擴增。在本試驗中所用引物的Tm值為53 ℃， 從

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，通過各個因素的綜合對比分析，得出反應(yīng)體系中4個因子的最佳濃度：0.25 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、50 ng/μL 模板DNA。PCR反應(yīng)條件：94℃預變性4min；94 ℃ 變性 45 s，UBC 835退火溫度是50 ℃，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

ISSR-PCR具有高重復性的優(yōu)點，但其擴增仍受多種因素的影響，如Mg2+用量、引物濃度、Taq[KG*3]DNA聚合酶用量、退火溫度、模板DNA等。試驗研究發(fā)現(xiàn)，模板DNA對ISSR-PCR擴增的影響不是很大，而Taq DNA聚合酶和Mg2+對其有很大的作用。Mg2+濃度控制Taq DNA聚合酶的活性，Taq DNA聚合酶的活性又是ISSR-PCR擴增的關(guān)鍵。而dNTP是PCR反應(yīng)的原料，濃度過高時容易導致錯配，同時dNTP會對Mg2+產(chǎn)生拮抗作用^[9]，退火溫度高低制約擴增條帶的分辨率。上述因素相互依賴、相互抑制。為獲得重復性好、可靠性高的擴增條帶^[10-11]，本試驗采用單因素試驗方法來確定各因素的最佳濃度。單因素試驗設(shè)計可對每個影響因子不同水平進行直觀的判斷。確定了沙地云杉ISSR-PCR各因素的最適濃度，試驗結(jié)果對沙地云杉進行遺傳多樣性分析等研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]李銀科，劉世增，康才周，等. 溫度對樟子松和沙地云杉種子萌發(fā)特征的影響[J]. 水土保持通報，2011，31（4）：73-77.

[2]劉瑞芬.沙地云杉引種實驗[J]. 內(nèi)蒙古林業(yè)調(diào)查設(shè)計，2008，31（6）：75-77，80.

[3]羅玥佶，伍賢進，彭 帥，等. 翻白草總DNA的提取與ISSR-PCR體系的建立與優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（3）：895-897，901.

[4]桂騰琴，喬愛民，孫 敏，等. 果梅ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化[J]. 西南大學學報：自然科學版，2007，29（10）：124-128.

[5]趙 謙，杜 虹，莊東紅. ISSR分子標記及其在植物研究中的應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2007，6（增刊1）：123-129.

[6]劉 娜，王昌命，普曉蘭. 云南松胚乳DNA提取與ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立[J]. 西南林學院學報，2009，29（2）：27-30.

[7]喬燕春，林順權(quán)，楊向暉，等. 均勻設(shè)計在枇杷ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化中的應(yīng)用[J]. 基因組學與應(yīng)用生物學，2009，28（1）：123-126.

[8]盧圣棟. 現(xiàn)代分子生物學實驗技術(shù)[M]. 2版.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，1999：57-58.

[9]王 亞，郭志強，王宏偉，等. 單雌蓖麻ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學，2010，38（1）：15-18.

[10]劉小溪，李枝林，賈文杰，等. 百合ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2012，40（1）：30-33.

[11]張 蕾，嚴 萍，韓正洲，等. 兩面針I(yè)SSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化[J]. 廣州中醫(yī)藥大學學報，2012，29（1）：70-74.

2.3 Taq DNA聚合酶的優(yōu)化

Taq DNA聚合酶的用量是影響擴增的重要因素，濃度過低會使酶過早地消耗完造成合成效率下降，濃度過高容易產(chǎn)生非特異性擴增且增加成本。從圖3可見，不同Taq DNA聚合酶濃度從0.5、1.0、1.5、2.0 U/μL均有擴增產(chǎn)物，濃度在0.5 U/μL條帶相對較弱，1.0、1.5、2.0 U/μL時擴增出的條帶無顯著差異，考慮穩(wěn)定性和成本，而且1.5 U/μL的條帶亮度高和穩(wěn)定性強。最終確定Taq DNA聚合酶用量為1.0 U/μL。

2.4 dNTPs濃度的優(yōu)化

dNTPs濃度與PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTPs能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。濃度高會導致片段缺失，而濃度太低又會導致擴增產(chǎn)率下降^[4]。從圖4中可見，dNTPs濃度為0.15、0.20、 0.25、0.30 mmol/L均有擴增條帶，dNTPs濃度為0.15、0.30 mmol/L時，擴增出的條帶較少；在0.20、0.25 mmol/L時擴增條帶較多，但0.25 mmol/L比0.20 mmol/L 條帶清晰。因此確定dNTPs濃度為0.25 mmol/L。

2.5 退火溫度的優(yōu)化

為了確定引物的最適退火溫度，參照所選引物序列計算理論退火溫度Tm，Tm=4（G+C）+2（A+T）^[8]。溫度低于Tm值，擴增產(chǎn)物特異性降低，擴增出來的條帶較弱；溫度過高不利于引物擴增。在本試驗中所用引物的Tm值為53 ℃， 從

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，通過各個因素的綜合對比分析，得出反應(yīng)體系中4個因子的最佳濃度：0.25 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、50 ng/μL 模板DNA。PCR反應(yīng)條件：94℃預變性4min；94 ℃ 變性 45 s，UBC 835退火溫度是50 ℃，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

ISSR-PCR具有高重復性的優(yōu)點，但其擴增仍受多種因素的影響，如Mg2+用量、引物濃度、Taq[KG*3]DNA聚合酶用量、退火溫度、模板DNA等。試驗研究發(fā)現(xiàn)，模板DNA對ISSR-PCR擴增的影響不是很大，而Taq DNA聚合酶和Mg2+對其有很大的作用。Mg2+濃度控制Taq DNA聚合酶的活性，Taq DNA聚合酶的活性又是ISSR-PCR擴增的關(guān)鍵。而dNTP是PCR反應(yīng)的原料，濃度過高時容易導致錯配，同時dNTP會對Mg2+產(chǎn)生拮抗作用^[9]，退火溫度高低制約擴增條帶的分辨率。上述因素相互依賴、相互抑制。為獲得重復性好、可靠性高的擴增條帶^[10-11]，本試驗采用單因素試驗方法來確定各因素的最佳濃度。單因素試驗設(shè)計可對每個影響因子不同水平進行直觀的判斷。確定了沙地云杉ISSR-PCR各因素的最適濃度，試驗結(jié)果對沙地云杉進行遺傳多樣性分析等研究奠定了基礎(chǔ)。

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[11]張 蕾，嚴 萍，韓正洲，等. 兩面針I(yè)SSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化[J]. 廣州中醫(yī)藥大學學報，2012，29（1）：70-74.

2.3 Taq DNA聚合酶的優(yōu)化

Taq DNA聚合酶的用量是影響擴增的重要因素，濃度過低會使酶過早地消耗完造成合成效率下降，濃度過高容易產(chǎn)生非特異性擴增且增加成本。從圖3可見，不同Taq DNA聚合酶濃度從0.5、1.0、1.5、2.0 U/μL均有擴增產(chǎn)物，濃度在0.5 U/μL條帶相對較弱，1.0、1.5、2.0 U/μL時擴增出的條帶無顯著差異，考慮穩(wěn)定性和成本，而且1.5 U/μL的條帶亮度高和穩(wěn)定性強。最終確定Taq DNA聚合酶用量為1.0 U/μL。

2.4 dNTPs濃度的優(yōu)化

dNTPs濃度與PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTPs能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。濃度高會導致片段缺失，而濃度太低又會導致擴增產(chǎn)率下降^[4]。從圖4中可見，dNTPs濃度為0.15、0.20、 0.25、0.30 mmol/L均有擴增條帶，dNTPs濃度為0.15、0.30 mmol/L時，擴增出的條帶較少；在0.20、0.25 mmol/L時擴增條帶較多，但0.25 mmol/L比0.20 mmol/L 條帶清晰。因此確定dNTPs濃度為0.25 mmol/L。

2.5 退火溫度的優(yōu)化

為了確定引物的最適退火溫度，參照所選引物序列計算理論退火溫度Tm，Tm=4（G+C）+2（A+T）^[8]。溫度低于Tm值，擴增產(chǎn)物特異性降低，擴增出來的條帶較弱；溫度過高不利于引物擴增。在本試驗中所用引物的Tm值為53 ℃， 從

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，通過各個因素的綜合對比分析，得出反應(yīng)體系中4個因子的最佳濃度：0.25 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、50 ng/μL 模板DNA。PCR反應(yīng)條件：94℃預變性4min；94 ℃ 變性 45 s，UBC 835退火溫度是50 ℃，退火45 s，72 ℃延伸2 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

ISSR-PCR具有高重復性的優(yōu)點，但其擴增仍受多種因素的影響，如Mg2+用量、引物濃度、Taq[KG*3]DNA聚合酶用量、退火溫度、模板DNA等。試驗研究發(fā)現(xiàn)，模板DNA對ISSR-PCR擴增的影響不是很大，而Taq DNA聚合酶和Mg2+對其有很大的作用。Mg2+濃度控制Taq DNA聚合酶的活性，Taq DNA聚合酶的活性又是ISSR-PCR擴增的關(guān)鍵。而dNTP是PCR反應(yīng)的原料，濃度過高時容易導致錯配，同時dNTP會對Mg2+產(chǎn)生拮抗作用^[9]，退火溫度高低制約擴增條帶的分辨率。上述因素相互依賴、相互抑制。為獲得重復性好、可靠性高的擴增條帶^[10-11]，本試驗采用單因素試驗方法來確定各因素的最佳濃度。單因素試驗設(shè)計可對每個影響因子不同水平進行直觀的判斷。確定了沙地云杉ISSR-PCR各因素的最適濃度，試驗結(jié)果對沙地云杉進行遺傳多樣性分析等研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]李銀科，劉世增，康才周，等. 溫度對樟子松和沙地云杉種子萌發(fā)特征的影響[J]. 水土保持通報，2011，31（4）：73-77.

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