張笛+張勇攀+錢文正+于恩琪+秦愛建+金文杰

摘要：以致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌分離株G8107菌株基因組DNA為模板，用PCR法擴增ompA precursor基因，PCR產(chǎn)物用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物回收與相同黏性末端的表達載體 pET-32a（+）連接構(gòu)建表達ompA precursor的重組質(zhì)粒，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達宿主菌BL21（DE3），抽提質(zhì)粒，酶切鑒定及測序正確后誘導表達。對轉(zhuǎn)化菌株以 IPTG 進行誘導后，裂解細菌，離心，上清進行 SDS-PAGE鑒定。測序結(jié)果顯示，ompA precursor基因大小為 1 014 bp，編碼 338 個氨基酸殘基，蛋白相對分子質(zhì)量約為36。原核表達產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE 分析表明，以28 ℃ 1.0 mmol/L 的 IPTG 誘導6 h，該基因表達效果最好。經(jīng)Western Blot檢測，表達的重組蛋白可與抗His標簽蛋白單抗反應。

關(guān)鍵詞：致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌；外膜蛋白前體；克隆與表達

中圖分類號：S858.33 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0032-03

鵝卵黃性腹膜炎是一種主要發(fā)生于產(chǎn)蛋種鵝的疾病^[1]。該病的發(fā)生主要是由于公鵝生殖器感染大腸桿菌，在交配的過程中傳染給母鵝，導致輸卵管感染大腸桿菌出現(xiàn)炎癥，最終導致卵黃性腹膜炎。該病會導致產(chǎn)蛋母鵝生產(chǎn)性能下降甚至絕產(chǎn)，嚴重的導致產(chǎn)蛋母鵝死亡，造成巨大的經(jīng)濟損失^[2-4]。大腸桿菌是自然界廣泛存在的條件性致病菌，其被發(fā)現(xiàn)后很長一段時間內(nèi)一直被當做腸道內(nèi)的正常菌群而非致病菌，后來人類才認識到某些血清型的大腸桿菌對人、畜禽具有致病性，當動物機體抵抗力下降或免疫功能受損時可引發(fā)感染。外膜蛋白A是廣泛存在于革蘭氏陰性腸桿菌外膜上的蛋白，OmpA precursor是大腸桿菌外膜蛋白A的前體蛋白。徐淑華以O(shè)mpA為指示蛋白，研究E.coli的Prlc基因產(chǎn)物對OmpA前體蛋白翻譯后轉(zhuǎn)位功能，結(jié)果表明，Prlc基因產(chǎn)物在一定程度上能增進OmpA的轉(zhuǎn)位定域^[5]。OmpA是細菌抗宿主殺傷因子，能維持細菌外膜結(jié)構(gòu)完整及細菌形態(tài)正常，同時在細菌黏附、侵襲起始過程中起關(guān)鍵作用。OmpA具有良好的免疫原性，是先天免疫系統(tǒng)的重要靶位，也可以在免疫逃逸中發(fā)揮重要作用^[6-8]。由于OmpA 蛋白的生物學特性，而且在革蘭氏陰性桿菌中OmpA蛋白普遍存在，因此也可以將其作為疫苗的候選分子^[9-10]。本研究選取差異蛋白OmpA前體蛋白，對蛋白進行體外克隆表達，進而探索蛋白在細菌中與宿主的關(guān)系，旨在為揭示蛋白功能及鵝卵黃性腹膜炎發(fā)生機理提供幫助。

1 材料與方法

1.1 菌種與載體

致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌菌株G8107由揚州大學江蘇省動物預防醫(yī)學重點實驗室分離保存。原核表達載體 pET-32a（+）、大腸桿菌BL21（DE3）均由該實驗室保存。

1.2 試劑

Tryptone、Yeast Extract為Oxiod公司產(chǎn)品；Taq酶、dNTP、10×buffer、1 kb marker、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ購自Fermantes生物工程公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物及凝膠純化回收試劑盒購自Axygen公司；PCR引物由華大基因合成；甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、NBT、咪唑為Amresco公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)純化鎳柱購自GE公司；蛋白marker 購自Fermantes公司；His 標簽抗體為筆者所在實驗室自制；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的大腸桿菌Escherichia coli O157：H7 str. EC1212 的ompA precursor基因序列設(shè)計PCR擴增引物，在上游引物5′末端加入EcoRⅠ 限制性酶切位點及保護性堿基，下游引物5′末端加入XhoⅠ限制性酶切位點及保護性堿基。引物序列為：上游引物：5′-CTGAATTCCTGGCACTGGCTGGTTTC-3′；下游引物：5′- ATCTCGAGTTAAGCCTGCGGCTGAGT-3′。PCR 擴增產(chǎn)物大小為1 014 bp。

1.4 PCR 擴增目的基因

以致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌菌株G8107基因組 DNA 為模板擴增ompA precursor基因片段，取新鮮培養(yǎng)的細菌菌液，12 000 r/min離心1 min，去上清，沉淀用100 μL超純水重懸，將重懸的沉淀煮沸10 min，-20 ℃凍存10 min，取出融化，12 000 r/min 離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中用于PCR。反應條件為 95 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，63 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 20 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書操作回收目的基因。

1.5 目的基因 ompA precursor的克隆及測序

回收的 PCR 產(chǎn)物、pET-32a（+）空載體質(zhì)粒用EcoRⅠ、 XhoⅠ雙酶切，再次回收產(chǎn)物，將ompA precursor 2次膠回收產(chǎn)物及雙酶切后的表達載體pET-32a（+）在連接酶的作用下于16 ℃過夜連接。取連接產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞內(nèi)（CaCl2法），涂布于含0.1%氨芐的LB 瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定正確的為陽性，將陽性細菌送測序，測序結(jié)果正確的細菌用于表達。

1.6 OmpA precursor融合蛋白表達條件摸索及蛋白純化

經(jīng)鑒定正確新鮮的ompA precursor陽性重組菌及含有pET-32a（+）質(zhì)粒的BL21（DE3）空載體菌按1 ∶100轉(zhuǎn)接種培養(yǎng)3 h，加入 IPTG，終濃度分別為0、0.25、0.5、0.75、1、1.25 mmol/L，28 ℃分別誘導 2、3、4、5、6 h，每隔1 h收獲相應細菌。等體積菌液4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用1 mL無菌PBS溶液洗滌，4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用400 μL無菌超輕水重懸，懸液超聲裂解，裂解液4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，取上清測定濃度，通過 SDS-PAGE 確定蛋白最佳表達條件。確定最佳表達條件后采用相同方法大量表達蛋白，裂解上清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用His標簽鎳柱對上清進行純化。

1.7 Western Blot驗證

將經(jīng)誘導表達、純化的上清加 6×上樣buffer混勻，沸水浴10 min，冰浴5 min，離心后取上清進行SDS-PAGE。按分子克隆方法，采用電轉(zhuǎn)移方法將膠中蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素薄膜上，5%脫脂乳4 ℃過夜封閉，一抗為筆者所在實驗室自制的抗His 標簽蛋白單抗腹水（稀釋度為1 ∶2 000），37 ℃作用1 h，二抗采用AP標記的羊抗鼠 IgG（稀釋度為 1 ∶30 000），37 ℃作用1 h，NBT顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 ompA基因的 PCR 擴增和表達質(zhì)粒的構(gòu)建

以致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌G8107基因組為模板進行 PCR 擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳，以1 kb marker為參照，在1 000 bp左右位置得到與預期大小一致的擴增條帶，結(jié)果如圖1所示。

將回收的ompA precursor PCR產(chǎn)物、pET-32a（+）空載體質(zhì)粒用EcoRⅠ、 XhoⅠ雙酶切，再次回收產(chǎn)物，進行1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到5 900、1 014 bp 2個目的條帶，結(jié)果如圖2所示。

將雙酶切后回收的ompA precursor片段及pET-32a（+）載體連接，構(gòu)建pET32a-pre-ompA重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒雙酶切后，可得到與目的基因（1 014 bp）及載體（5 900 bp）大小相同的2個片段，如圖3所示。將重組細菌送測序鑒定，結(jié)果正確。

2.3 pET32a-pre-ompA重組表達蛋白Western Blot鑒定

將純化后的蛋白上清進行SDS-PAGE蛋白電泳，隨后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上進行Western Blot分析，在分子量 54 ku 處可見陽性條帶（圖10）。

3 結(jié)論與討論

鵝卵黃性腹膜炎別稱鵝蛋子瘟，是一種主要發(fā)生于產(chǎn)蛋種鵝的疾病，能導致鵝生產(chǎn)性能下降甚至死亡。目前，有關(guān)鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌的致病機理仍不清楚。1977 年，Chai等發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的 OmpA 蛋白是大腸桿菌外膜上的主要蛋白^[10]。1984 年 Morona等預測 OmpA 蛋白為多次跨膜結(jié)構(gòu)^[11]。1998 年 Pautsch等描述了第1個 OmpA 蛋白的晶體結(jié)構(gòu)^[12]。本研究的OmpA precursor為二維電泳差異蛋白。研究表明，大腸桿菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性并且能夠誘導機體脾淋巴細胞增殖，增強了淋巴細胞活化，在免疫反應中具有重要作用^[13]。OmpA 普遍存在于大腸桿菌菌體外膜中，是大腸桿菌重要的毒力因子，參與大腸桿菌對宿主細胞的黏附作用與侵襲功能^[14]。本研究成功克隆了致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌的外膜蛋白A前體蛋白基因，并在原核表達載體pET-32a（+）中成功表達，同時確定了最佳表達時間、溫度及誘導劑IPTG的濃度。Western Blot結(jié)果表明，融合蛋白能夠與抗His標簽蛋白單抗腹水反應。由于本研究期望獲得可溶性表達并盡量保持蛋白原空間構(gòu)象的完整，因此只選擇細菌裂解上清進行鎳柱純化，對于包涵體中的蛋白并未用常用的中性去垢劑例如吐溫、NP40進行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化的蛋白在透析及濃縮的過程中極易發(fā)生析出，同時凍融后極易發(fā)生降解。免疫印跡試驗存在雜條帶，初步分析這可能是OmpA前體蛋白發(fā)生降解的原因，應作進一步研究。

參考文獻：

[1]王永坤，田慧芳. 鵝蛋子瘟防治的研究[J]. 中國禽業(yè)導刊，2003，20（11）：19-20.

[2]吳立芬. 母鵝卵黃性腹膜炎的發(fā)生及防治[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（13）：339.

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[8]Sukumaran S K，Shimada H，Prasadarao N V. Entry and intracellular replication of Escherichia coli K1 in macrophages require expression of outer membrane protein A[J]. Infection and Immunity，2003，71（10）：5951-5961.

[9]呼 銳，佟春玉，崔玉東.大腸桿菌外膜蛋白A在原核表達載體中的克隆表達[J]. 黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2011，23（1）：56-59.

[10]Chai T J，F(xiàn)oulds J.Purification of protein A，an outer membrane component missing in Escherichia coli K-12 ompA mutants[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1977，493（1）：210-215.

[11]Morona R，Klose M，Henning U. Escherichia coli K-12 outer membrane protein（OmpA） as a bacteriophage receptor：analysis of mutant genes expressing altered proteins[J]. Journal of Bacteriology，1984，159（2）：570-578.

[12]Pautsch A，Schulz G E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain[J]. Nature Structural Biology，1998，5（11）：1013-1017.

[13]李曉霞，邱玉玉，王海榮. 腸致病性大腸桿菌外膜蛋白免疫保護性研究[J]. 中國免疫學雜志，2007，23（5）：394-397.

[14]宋 舟，陳 偉，張立艷，等. 大腸桿菌外膜蛋白A研究進展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（5）：199-202.

1.7 Western Blot驗證

將經(jīng)誘導表達、純化的上清加 6×上樣buffer混勻，沸水浴10 min，冰浴5 min，離心后取上清進行SDS-PAGE。按分子克隆方法，采用電轉(zhuǎn)移方法將膠中蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素薄膜上，5%脫脂乳4 ℃過夜封閉，一抗為筆者所在實驗室自制的抗His 標簽蛋白單抗腹水（稀釋度為1 ∶2 000），37 ℃作用1 h，二抗采用AP標記的羊抗鼠 IgG（稀釋度為 1 ∶30 000），37 ℃作用1 h，NBT顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 ompA基因的 PCR 擴增和表達質(zhì)粒的構(gòu)建

以致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌G8107基因組為模板進行 PCR 擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳，以1 kb marker為參照，在1 000 bp左右位置得到與預期大小一致的擴增條帶，結(jié)果如圖1所示。

將回收的ompA precursor PCR產(chǎn)物、pET-32a（+）空載體質(zhì)粒用EcoRⅠ、 XhoⅠ雙酶切，再次回收產(chǎn)物，進行1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到5 900、1 014 bp 2個目的條帶，結(jié)果如圖2所示。

將雙酶切后回收的ompA precursor片段及pET-32a（+）載體連接，構(gòu)建pET32a-pre-ompA重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒雙酶切后，可得到與目的基因（1 014 bp）及載體（5 900 bp）大小相同的2個片段，如圖3所示。將重組細菌送測序鑒定，結(jié)果正確。

2.3 pET32a-pre-ompA重組表達蛋白Western Blot鑒定

將純化后的蛋白上清進行SDS-PAGE蛋白電泳，隨后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上進行Western Blot分析，在分子量 54 ku 處可見陽性條帶（圖10）。

3 結(jié)論與討論

鵝卵黃性腹膜炎別稱鵝蛋子瘟，是一種主要發(fā)生于產(chǎn)蛋種鵝的疾病，能導致鵝生產(chǎn)性能下降甚至死亡。目前，有關(guān)鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌的致病機理仍不清楚。1977 年，Chai等發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的 OmpA 蛋白是大腸桿菌外膜上的主要蛋白^[10]。1984 年 Morona等預測 OmpA 蛋白為多次跨膜結(jié)構(gòu)^[11]。1998 年 Pautsch等描述了第1個 OmpA 蛋白的晶體結(jié)構(gòu)^[12]。本研究的OmpA precursor為二維電泳差異蛋白。研究表明，大腸桿菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性并且能夠誘導機體脾淋巴細胞增殖，增強了淋巴細胞活化，在免疫反應中具有重要作用^[13]。OmpA 普遍存在于大腸桿菌菌體外膜中，是大腸桿菌重要的毒力因子，參與大腸桿菌對宿主細胞的黏附作用與侵襲功能^[14]。本研究成功克隆了致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌的外膜蛋白A前體蛋白基因，并在原核表達載體pET-32a（+）中成功表達，同時確定了最佳表達時間、溫度及誘導劑IPTG的濃度。Western Blot結(jié)果表明，融合蛋白能夠與抗His標簽蛋白單抗腹水反應。由于本研究期望獲得可溶性表達并盡量保持蛋白原空間構(gòu)象的完整，因此只選擇細菌裂解上清進行鎳柱純化，對于包涵體中的蛋白并未用常用的中性去垢劑例如吐溫、NP40進行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化的蛋白在透析及濃縮的過程中極易發(fā)生析出，同時凍融后極易發(fā)生降解。免疫印跡試驗存在雜條帶，初步分析這可能是OmpA前體蛋白發(fā)生降解的原因，應作進一步研究。

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1.7 Western Blot驗證

將經(jīng)誘導表達、純化的上清加 6×上樣buffer混勻，沸水浴10 min，冰浴5 min，離心后取上清進行SDS-PAGE。按分子克隆方法，采用電轉(zhuǎn)移方法將膠中蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素薄膜上，5%脫脂乳4 ℃過夜封閉，一抗為筆者所在實驗室自制的抗His 標簽蛋白單抗腹水（稀釋度為1 ∶2 000），37 ℃作用1 h，二抗采用AP標記的羊抗鼠 IgG（稀釋度為 1 ∶30 000），37 ℃作用1 h，NBT顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 ompA基因的 PCR 擴增和表達質(zhì)粒的構(gòu)建

以致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌G8107基因組為模板進行 PCR 擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳，以1 kb marker為參照，在1 000 bp左右位置得到與預期大小一致的擴增條帶，結(jié)果如圖1所示。

將回收的ompA precursor PCR產(chǎn)物、pET-32a（+）空載體質(zhì)粒用EcoRⅠ、 XhoⅠ雙酶切，再次回收產(chǎn)物，進行1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到5 900、1 014 bp 2個目的條帶，結(jié)果如圖2所示。

將雙酶切后回收的ompA precursor片段及pET-32a（+）載體連接，構(gòu)建pET32a-pre-ompA重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒雙酶切后，可得到與目的基因（1 014 bp）及載體（5 900 bp）大小相同的2個片段，如圖3所示。將重組細菌送測序鑒定，結(jié)果正確。

2.3 pET32a-pre-ompA重組表達蛋白Western Blot鑒定

將純化后的蛋白上清進行SDS-PAGE蛋白電泳，隨后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上進行Western Blot分析，在分子量 54 ku 處可見陽性條帶（圖10）。

3 結(jié)論與討論

鵝卵黃性腹膜炎別稱鵝蛋子瘟，是一種主要發(fā)生于產(chǎn)蛋種鵝的疾病，能導致鵝生產(chǎn)性能下降甚至死亡。目前，有關(guān)鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌的致病機理仍不清楚。1977 年，Chai等發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的 OmpA 蛋白是大腸桿菌外膜上的主要蛋白^[10]。1984 年 Morona等預測 OmpA 蛋白為多次跨膜結(jié)構(gòu)^[11]。1998 年 Pautsch等描述了第1個 OmpA 蛋白的晶體結(jié)構(gòu)^[12]。本研究的OmpA precursor為二維電泳差異蛋白。研究表明，大腸桿菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性并且能夠誘導機體脾淋巴細胞增殖，增強了淋巴細胞活化，在免疫反應中具有重要作用^[13]。OmpA 普遍存在于大腸桿菌菌體外膜中，是大腸桿菌重要的毒力因子，參與大腸桿菌對宿主細胞的黏附作用與侵襲功能^[14]。本研究成功克隆了致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌的外膜蛋白A前體蛋白基因，并在原核表達載體pET-32a（+）中成功表達，同時確定了最佳表達時間、溫度及誘導劑IPTG的濃度。Western Blot結(jié)果表明，融合蛋白能夠與抗His標簽蛋白單抗腹水反應。由于本研究期望獲得可溶性表達并盡量保持蛋白原空間構(gòu)象的完整，因此只選擇細菌裂解上清進行鎳柱純化，對于包涵體中的蛋白并未用常用的中性去垢劑例如吐溫、NP40進行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化的蛋白在透析及濃縮的過程中極易發(fā)生析出，同時凍融后極易發(fā)生降解。免疫印跡試驗存在雜條帶，初步分析這可能是OmpA前體蛋白發(fā)生降解的原因，應作進一步研究。

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