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        野牛草基因組DNA提取方法的篩選

        2014-10-23 19:08:43張曉波許沛東趙艷
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年8期

        張曉波+許沛東+趙艷

        摘要:采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法、十二烷基磺酸鈉(SDS)法以及高鹽法3種方法對野牛草葉片的基因組DNA進(jìn)行提取,并利用分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測比較3種方法提取DNA的純度與濃度。結(jié)果表明,3種方法提取到的野牛草葉片DNA的純度、完整性都較好,質(zhì)量從高到低依次為CTAB法>高鹽法>SDS法,產(chǎn)率依次為SDS法>CTAB法>高鹽法,綜合來看CTAB法是提取野牛草基因組DNA的最佳方法。

        關(guān)鍵詞:野牛草;DNA提??;CTAB法;SDS法;高鹽法

        中圖分類號:S688.403 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

        文章編號:1002-1302(2014)08-0026-03

        野牛草是廣泛種植于我國西北、華北及東北地區(qū)的暖季型草坪草,在20世紀(jì)50年代初由中科院胡淑良先生從美國引進(jìn)[1-2]。野牛草耐旱性強(qiáng),在年降水量300~600 mm的干旱、半干旱地區(qū)也可以正常生長,在持續(xù)干旱2~3個月的夏季生長狀況依舊良好。野牛草喜pH值為6.1~8.0的黏質(zhì)土壤,但在高原丘陵瘠薄土壤上也可頑強(qiáng)生長;野牛草具有較強(qiáng)的耐寒性,在我國北方大部分地區(qū)都可越冬,甚至在西北、東北的寒冷地帶-39°C的低溫條件下也可以正常越冬[3-6]。由于野牛草良好的抗逆性,應(yīng)用廣泛,對其研究也越來越多,但主要集中在品種選育[7-9]和抗逆性[3,10-12]的研究方面,而對野牛草基因組DNA的研究相對較少。然而,對于我國這個水資源平均占有量不足世界平均水平1/4,被聯(lián)合國列入世界13個貧水國之一的國家來說[13],收集優(yōu)質(zhì)草坪種質(zhì)材料,對其生物學(xué)特征及遺傳多樣性進(jìn)行分析鑒定研究,篩選具有觀賞價值和節(jié)水環(huán)保作用的草坪品種,有著廣泛的應(yīng)用前景和現(xiàn)實意義的。關(guān)于植物基因組DNA提取方法,國內(nèi)外都有一定的研究,包括高粱等作物[14]、紅掌等花卉[15]以及狗牙根等草坪草[16-17]。本試驗結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)研究,參考Staub等的研究方法[18-20],針對野牛草的特性,如葉片纖維含量高,具有絨毛、韌性高的特點,對適合基因組DNA提取的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法、十二烷基磺酸鈉(SDS)法、高鹽法3種方法進(jìn)行比較,篩選出最佳方法。旨在為野牛草未來的遺傳多樣性研究提供一定的參考,同時也為適應(yīng)我國城市綠化以及西部生態(tài)環(huán)境建設(shè)的需要,培育適合我國國情的環(huán)保型耐旱草坪植物奠定一定的基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        供試材料為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所培育的野牛草品系植株。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 野牛草基因組DNA的提取方法

        CTAB法:(1)取野牛草葉片3~5 g,用蒸餾水洗凈,吸干表面水珠后置于 1.5 mL 離心管中,加入適量液氮致冷,研成細(xì)粉;(2)吸取 900 μL 提前預(yù)熱到65 ℃的CTAB提取液加入到樣品中混勻;(3)將離心管放入水浴槽中,在65 ℃的溫度下浸提15~20 min,每 2 min 取出充分混勻;(4)取出冷卻后,加入500 μL三氯甲烷-異戊醇(24 ∶1),振蕩5 min;(5)在6 000~8 000 r/min 下離心10 min;(6)棄上清液,重復(fù)4~5步;(7)取出上清液后,加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉和等體積異丙醇,搖勻至出現(xiàn)白色絮狀沉淀;(8)在12 000 r/min下離心5 min,棄上清液;(9)用75%乙醇清洗2次,在室溫干燥1 h后溶入200 μL的TE緩沖液(2 mol/L Tris-HCl;0.5 mol/L EDTA),在4 ℃的溫度條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

        SDS法:(1)取葉片0.05~0.1 g,置于1.5 mL離心管中,適量液氮冷凍后研磨成粉;(2)加入400 μL預(yù)熱至 65 ℃ 的緩沖液(100 mmol/L Tris-Cl,pH值8.0;50 mmol/L EDTA;500 mmol/L NaCl;15 mg/mL SDS;10 mmol/L 2-巰基乙醇;30 mg/mL PVP);(3)混勻后置于65 ℃的水浴中0.5~1 h;(4)冷卻后,加入1/3體積的5 mol/L KAC,置于冰箱 10 min,取出后再加入1/3體積的三氯甲烷/異戊醇,混勻后離心 10 min;(5)將上清移至另1支加入了等體積預(yù)冷異丙醇的離心管中,輕輕混勻,在13 000 r/min下離心10 min;(6)棄上清,用70%乙醇洗滌沉淀2次,在室溫下干燥;(7)加入 50 μL TE 溶解沉淀,經(jīng)RNase酶消化后保存?zhèn)溆谩?/p>

        高鹽法:(1)取0.05~0.1 g 葉片,加入液氮研成粉末后分裝于1.5 mL的離心管中;(2)加入400 μL DNA 高鹽提取緩沖液(200 mmol/L Tris-HCl,pH值8.0;2 mmol/L NaCl;70 mmol/L EDTA,pH值8.0),加入100 μL 5%肌氨酸鈉,混勻;(3)放入65 ℃水浴鍋中保溫30 min,其間翻轉(zhuǎn)離心管2~3次;(4)冷卻后在13 000 r/min 離心15 min,取上清液至新離心管中,加入RNase酶37 ℃保溫30~60 min;(5)然后加入等體積三氯甲烷/異戊醇(24 ∶1),混勻,13 000 r/min下離心 10 min;(6)取上清液至新的離心管中,加入0.2倍體積的 10 mol/L NH4Ac和0.7倍體積的異丙醇,混勻,放入-20 ℃冰箱中靜置30 min;(7)在13 000 r/min下離心15 min,棄上清,倒置離心管1 min;(8)加入70%乙醇500 μL洗滌,在 13 000 r/min 下離心2~3 min,棄上清液,重復(fù)洗凈2次,于室溫下晾干;(9)加入30~50 μL TE,65 ℃水浴中溶解 30 min,放入-20 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?

        1.2.2 基因組DNA純度檢測

        制備0.8%瓊脂糖凝膠,取DNA 2 μL,在1×TAE緩沖液、電場強(qiáng)度3~5 V/cm條件下電泳60~90 min。放入紫外燈下觀察、拍照,觀察點樣孔及整個泳道,判斷DNA樣品純度。

        1.2.3 基因組DNA總濃度測定

        將4 μL DNA樣品和 396 μL TE混勻后,放入分光光度計中測量并記錄DNA樣品D260 nm/D280 nm值以及DNA濃度,若D260 nm/D280 nm值在1.8~2.0之間時,說明DNA樣品純度好,適于作RAPD分析。同時根據(jù)D260 nm值為1的DNA樣品濃度為50 ng/μL計算DNA濃度,計算公式為:

        2 結(jié)果與分析

        2.1 DNA電泳檢測結(jié)果

        采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對用CTAB等3種方法提取的DNA分別進(jìn)行純度檢測,結(jié)果(圖1)表明,3種方法所提取到的DNA譜帶亮度差異不明顯,觀察DNA泳道,背景都比較清晰,說明DNA的完整性較好,蛋白質(zhì)、RNA及其他雜質(zhì)均比較少,可以滿足RAPD試驗的要求。檢測結(jié)果表明3種方法都可用于野牛草基因組DNA的提取。

        2.2 DNA總濃度測定結(jié)果

        試驗用3種不同提取方法均得到了野牛草葉片的基因組DNA,但在純度和產(chǎn)率上有一定的差別。如表1所示,SDS法產(chǎn)率最高,達(dá)到310~375 ng/mg之間,但其質(zhì)量最差,D260 nm/D280 nm 值為1.25~1.60,若想達(dá)到試驗要求還須繼續(xù)純化;CTAB法所提DNA質(zhì)量最好,D260 nm/D280 nm比值為 1.76~1.94,且產(chǎn)率較高,達(dá)到240~360 ng/mg;高鹽法所提DNA質(zhì)量和產(chǎn)率均處于CTAB法和SDS法之間,D260 nm/D280 nm 值為1.57~1.82,產(chǎn)率為230~360 ng/mg。綜合來看,3種方法提取到的野牛草葉片DNA的純度、完整性都較好,但CTAB法提取的D260 nm/D280 nm比值最高,所以CTAB法是提取野牛草基因組DNA的最佳方法。

        3 結(jié)論與討論

        獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的DNA樣品,是進(jìn)行PCR等分子生物學(xué)試驗的前提。目前,根據(jù)研究目的和研究對象的差異,國內(nèi)外研究者往往都采取不同的DNA提取方法[21-27]。其中有使用較通用方法的,也有針對某一具體物種或針對含多糖、多酚等次生代謝物植物而使用改良方法的。而如果所提取的DNA樣品用于PCR分析,則DNA提取的步驟越少越好,否則多步驟多試劑容易造成交叉污染,而PCR極其靈敏,步驟繁多容易影響PCR的準(zhǔn)確性[26]

        本試驗針對野牛草葉片纖維含量較高,具有絨毛、韌性高等特點,設(shè)計采用CTAB法、SDS法以及高鹽法分別提取到了野牛草基因組DNA,并對3種方法進(jìn)行比較,對所得DNA的濃度和純度進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明,3種不同的方法均可提取野牛草葉片的基因組DNA,但在純度和產(chǎn)率上卻有著明顯的差別。SDS法產(chǎn)率最高,但質(zhì)量最差,D260 nm/D280 nm值為1.25~1.60,需要繼續(xù)純化才能用于RAPD反應(yīng);CTAB法所提取到的DNA質(zhì)量最好,顏色為白色,D260 nm/D280 nm值為 1.76~1.93,且產(chǎn)率較高,可達(dá)240~355 ng/mg;高鹽法所提取得到的DNA質(zhì)量和產(chǎn)率均介于其他2種方法之間。

        所述,CTAB法、SDS法以及高鹽法提取的野牛草葉片基因組DNA的純度和完整性都較好,其中以CTAB法提取的DNA D值最高。因此,提取野牛草基因組DNA的最佳方法是CTAB法。

        但是,在利用CTAB法提取野牛草基因組DNA時,需要注意以下幾點問題:(1)野牛草葉片的纖維含量較高,且具有絨毛、韌性高等特點,短時間的研磨不能完全破壞野牛草葉片細(xì)胞的細(xì)胞壁,所以在提取過程用液氮研磨時一定要充分;(2)CTAB緩沖液一定要現(xiàn)配現(xiàn)用,并且為了使其更好地發(fā)揮裂解作用,一定要預(yù)熱,并在緩沖液中加入2% PVP;(3)在研磨前加入2% β-巰基乙醇。如果在溫度過高的季節(jié)提取,要盡量使用超低溫離心機(jī);(4)機(jī)械張力極其容易造成DNA分子的斷裂,所以在抽提過程中,要小心操作;此外,為獲得較高濃度的DNA,可以在吸取上清液減少的前提下,盡量減少抽提次數(shù)。

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