周小青　歐陽(yáng)娟　劉曉平　葉軍明　曾桂芳　楊斌　張國(guó)輝　葉斌

【摘要】 目的：探討GCC mRNA在淋巴結(jié)陰性（pN0）直腸癌患者淋巴結(jié)中表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。方法：應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)60例pN0直腸癌淋巴結(jié)中GCC mRNA表達(dá)水平，并分為GCC mRNA陽(yáng)性組（pN0（mol+））16例與陰性組（pN0（mol-））44例。分析兩組患者的局部復(fù)發(fā)率、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率、無(wú)瘤生存期（DFS）與GCC mRNA表達(dá)水平的關(guān)系。結(jié)果：GCC mRNA陰性組的局部復(fù)發(fā)率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率更低（P<0.05），無(wú)瘤生存期更長(zhǎng)（P<0.05）；TNM分期中T3～T4淋巴結(jié)GCC mRNA表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于T1～T2（P<0.05）。結(jié)論：GCC mRNA表達(dá)水平與患者的預(yù)后密切相關(guān)，提示GCC mRNA可作為直腸癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的有效分子學(xué)檢測(cè)指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】 直腸癌； 淋巴結(jié)； GCC mRNA； 預(yù)后

近30年來(lái)，直腸癌外科治療取得長(zhǎng)足進(jìn)步，但5年生存率仍徘徊在50%左右，大約50%患者死于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，其中局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是直腸癌復(fù)發(fā)的重要因素。即使是不存在局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的pN0直腸癌，復(fù)發(fā)率也高達(dá)20%～30%，癌細(xì)胞在淋巴結(jié)中的隱匿性轉(zhuǎn)移則是pN0直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要因素。鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶C（Guanylyl cyclases C，GCC/GUCYC）是受體鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶家族成員之一，高選擇性表達(dá)于腸道上皮細(xì)胞，普遍過(guò)表達(dá)于結(jié)腸直腸癌細(xì)胞（>80%），可作為結(jié)腸直腸癌的標(biāo)志分子[1]。本研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）方法檢測(cè)pN0直腸癌患者淋巴結(jié)中GCC mRNA的表達(dá)水平，并分析患者預(yù)后與GCC mRNA表達(dá)水平的關(guān)系，以探討GCC mRNA能否作為判斷淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的可靠指標(biāo)及其對(duì)直腸癌的分子分期以及預(yù)后判斷的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月-2012年6月本院收住的60例直腸癌患者，納入標(biāo)準(zhǔn)為：術(shù)前腸鏡病理證實(shí)為直腸癌，術(shù)中清掃淋巴結(jié)數(shù)≥12枚，術(shù)后病理確診系直腸癌且淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移（pN0）。60例患者中，男36例，女24例，男女比例為1.5：1；年齡34～70歲，中位年齡55歲，平均52.3歲；其中低分化腺癌21例，中-高分化腺癌39例；TNM分期：T1 8例，T2 19例，T3 18例，T4 15例。將60例患者根據(jù)PT-PCR檢測(cè)淋巴結(jié)GCC mRNA的表達(dá)分為陽(yáng)性組（pN0（mol+））16例與陰性組（pN0（mol-））44例。

1.2 主要儀器與試劑 Trizol購(gòu)自Gibco公司，DEPC水購(gòu)自Spectrum，MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司，PCR儀為Biosafer 970儀。

1.3 RT-PCR方法檢測(cè)GCC mRNA表達(dá)

1.3.1 總RNA提取 取淋巴結(jié)組織置于2 mL去RNA酶Eppendord管中，加入200 μL Trizol，組織勻漿器研碎后，再加入800 μL Trizol，混勻，靜置5 min使組織充分裂解，加入200 μL氯仿，劇烈振蕩20 s，室溫靜置2 min，4 ℃，12 000×g離心10 min，吸取水相加等體積異丙醇，室溫靜置10 min，4 ℃，12 000×g離心10 min，上清液，加75%乙醇1.0 mL清洗，7500×g離心5 min，2次，棄上清液，室溫干燥后DEPC水溶解，測(cè)濃度后-70 ℃保存。

1.3.2 PT-PCR 取1 μg總RNA加隨機(jī)引物0.5 μg混勻，70 ℃水浴5 min后速冷，加逆轉(zhuǎn)錄酶200 U、dNTP μL及RNA抑制劑25 U，37℃水浴1 h后置95 ℃ 5 min。擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，63 ℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。以水及良性組織淋巴結(jié)為陰性對(duì)照，并設(shè)no RT對(duì)照；PCR產(chǎn)物以2.5%瓊脂糖凝膠電泳、溴乙錠染色；產(chǎn)物序列測(cè)序證實(shí)。

1.4 病例隨訪(fǎng) 對(duì)兩組患者進(jìn)行密切隨訪(fǎng)，第1～2年，每3個(gè)月一次；第3年以后，每6個(gè)月一次，隨訪(fǎng)期間常規(guī)體格檢查，并予查血CEA、CA19-9、CA72-4，腹盆腔CT，胸部X-Ray；統(tǒng)計(jì)分析復(fù)發(fā)率、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率、無(wú)瘤生存期等指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

淋巴結(jié)GCC mRNA陽(yáng)性組復(fù)發(fā)率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較陰性組高，無(wú)瘤生存期較陰性組短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。TNM分期中T3～T4淋巴結(jié)GCC mRNA表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于T1～T2（P<0.05），見(jiàn)表2。兩組不同分期的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況見(jiàn)表3。

表1 兩組觀察指標(biāo)的比較

組別 局部復(fù)發(fā)

例（%） 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

例（%） 2年無(wú)瘤生存期（月）

陽(yáng)性組（n=16） 4（25.00） 4（25.00） 20.06±6.04

陰性組（n=44） 2（4.55） 1（2.27） 23.36±2.29

字2/t值 5.4545 7.934 3.0969

P值 0.0380 0.015 0.0030

3 討論

全球每年因直腸癌死亡的人數(shù)高達(dá)50多萬(wàn)，在發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率僅次于肺癌；目前在我國(guó)大城市直腸癌的發(fā)病率和死亡率均居第2位。近30年來(lái)，直腸癌外科治療取得長(zhǎng)足進(jìn)步，但其5年生存率仍徘徊在50%左右，大約50%的患者死于腹腔局部或區(qū)域的復(fù)發(fā)和肝轉(zhuǎn)移，其中局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是直腸癌復(fù)發(fā)的重要預(yù)測(cè)因素，有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的復(fù)發(fā)率高達(dá)50%。即使是不存在局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的pN0直腸癌患者，復(fù)發(fā)率也高達(dá)20%～30% ，其中癌細(xì)胞在淋巴結(jié)中的隱匿性轉(zhuǎn)移則是導(dǎo)致直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要因素。endprint

傳統(tǒng)的分期方法主要借助組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果，其局限主要體現(xiàn)在：（1）組織病理學(xué)檢查本身的敏感性低，其分辨率最高僅為從200個(gè)正常細(xì)胞中檢出1個(gè)腫瘤細(xì)胞；（2）僅能納入淋巴結(jié)的少量淋巴組織進(jìn)行分析，易遺漏腫瘤細(xì)胞；（3）僅能納入少數(shù)淋巴結(jié)進(jìn)行分析，易遺漏陽(yáng)性淋巴結(jié)；故pN0并不代表淋巴結(jié)沒(méi)有腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。GCC是受體鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶家族成員之一，人類(lèi)GUCYC基因定位于12號(hào)染色體，約85 kb，有27個(gè)外顯子，含3745 bp核苷酸序列[2]。GUCYG在正常小腸黏膜上皮細(xì)胞及原發(fā)或繼發(fā)性的結(jié)腸直腸惡性腫瘤中表達(dá)，是結(jié)腸直腸的高度特異性的生物學(xué)指標(biāo)[1-3]。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是RT-PCR技術(shù)的成熟和完善，其應(yīng)用于檢測(cè)隱匿性轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞已成為目前研究的熱點(diǎn)[4-6]。RT-PCR技術(shù)檢測(cè)隱匿性轉(zhuǎn)移的優(yōu)越性，從理論上分析，檢測(cè)轉(zhuǎn)移用測(cè)定mRNA的RT-PCR優(yōu)于測(cè)定蛋白質(zhì)的免疫學(xué)技術(shù)，因?yàn)椋海?）mRNA在細(xì)胞外很不穩(wěn)定，只要在組織或體液中測(cè)出特異性RNA，就意味著有腫瘤細(xì)胞的存在；（2）有些腫瘤細(xì)胞可轉(zhuǎn)錄組織特異性抗原的mRNA，但無(wú)該抗原蛋白合成；（3）RT-PCR相對(duì)免疫學(xué)技術(shù)易行，只要待測(cè)基因序列，即可設(shè)計(jì)引物作RT-PCR，而免疫學(xué)技術(shù)則需不斷生產(chǎn)特異性抗體；（4）很少量的癌細(xì)胞即可被檢出，可以檢出約106～107個(gè)正常細(xì)胞中夾雜的1個(gè)腫瘤細(xì)胞；（5）可以同時(shí)對(duì)大量標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)并且整個(gè)過(guò)程只需1～2 d；（6）提取整塊淋巴結(jié)組織的RNA進(jìn)行檢測(cè)，克服了傳統(tǒng)組織學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)方法只能切取數(shù)個(gè)淋巴結(jié)切面的缺點(diǎn)。

本研究利用RT-PCR檢測(cè)pN0直腸癌患者淋巴結(jié)中GUCYG mRNA的表達(dá)情況，分析不同表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系。研究顯示淋巴結(jié)GCC mRNA陽(yáng)性表達(dá)組復(fù)發(fā)率與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較陰性組高，2年無(wú)瘤生存期較陰性組短，相同T分期患者淋巴結(jié)GCC mRNA表達(dá)陽(yáng)性組預(yù)后較陰性組差，其中T3～T4淋巴結(jié)GCC mRNA表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于T1～T2，但5年的無(wú)瘤生存期、總生存期及相關(guān)亞組分析還有待進(jìn)一步觀察；對(duì)于GCC mRNA陽(yáng)性表達(dá)者預(yù)后差，具體機(jī)制還有待探索，可能同GCC mRNA通過(guò)cGMP依賴(lài)的相關(guān)機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)大腸癌細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)[7-10]。

本研究提示GCC mRNA可作為淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的可靠指標(biāo)，對(duì)直腸癌的分子生物學(xué)分期以及預(yù)后判斷有指導(dǎo)意義，可為直腸癌的治療方案提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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[10] Bustin S A，Gyselman V G，Williams N S，et al.Detection of cytokeratins 19/20 and guanylyl cyclase C in peripheral blood of colorectal cancer patients[J].Br J Cancer，1999，79（11-12）：1813-1820.

（收稿日期：2014-03-23） （本文編輯：蔡元元）endprint

傳統(tǒng)的分期方法主要借助組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果，其局限主要體現(xiàn)在：（1）組織病理學(xué)檢查本身的敏感性低，其分辨率最高僅為從200個(gè)正常細(xì)胞中檢出1個(gè)腫瘤細(xì)胞；（2）僅能納入淋巴結(jié)的少量淋巴組織進(jìn)行分析，易遺漏腫瘤細(xì)胞；（3）僅能納入少數(shù)淋巴結(jié)進(jìn)行分析，易遺漏陽(yáng)性淋巴結(jié)；故pN0并不代表淋巴結(jié)沒(méi)有腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。GCC是受體鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶家族成員之一，人類(lèi)GUCYC基因定位于12號(hào)染色體，約85 kb，有27個(gè)外顯子，含3745 bp核苷酸序列[2]。GUCYG在正常小腸黏膜上皮細(xì)胞及原發(fā)或繼發(fā)性的結(jié)腸直腸惡性腫瘤中表達(dá)，是結(jié)腸直腸的高度特異性的生物學(xué)指標(biāo)[1-3]。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是RT-PCR技術(shù)的成熟和完善，其應(yīng)用于檢測(cè)隱匿性轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞已成為目前研究的熱點(diǎn)[4-6]。RT-PCR技術(shù)檢測(cè)隱匿性轉(zhuǎn)移的優(yōu)越性，從理論上分析，檢測(cè)轉(zhuǎn)移用測(cè)定mRNA的RT-PCR優(yōu)于測(cè)定蛋白質(zhì)的免疫學(xué)技術(shù)，因?yàn)椋海?）mRNA在細(xì)胞外很不穩(wěn)定，只要在組織或體液中測(cè)出特異性RNA，就意味著有腫瘤細(xì)胞的存在；（2）有些腫瘤細(xì)胞可轉(zhuǎn)錄組織特異性抗原的mRNA，但無(wú)該抗原蛋白合成；（3）RT-PCR相對(duì)免疫學(xué)技術(shù)易行，只要待測(cè)基因序列，即可設(shè)計(jì)引物作RT-PCR，而免疫學(xué)技術(shù)則需不斷生產(chǎn)特異性抗體；（4）很少量的癌細(xì)胞即可被檢出，可以檢出約106～107個(gè)正常細(xì)胞中夾雜的1個(gè)腫瘤細(xì)胞；（5）可以同時(shí)對(duì)大量標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)并且整個(gè)過(guò)程只需1～2 d；（6）提取整塊淋巴結(jié)組織的RNA進(jìn)行檢測(cè)，克服了傳統(tǒng)組織學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)方法只能切取數(shù)個(gè)淋巴結(jié)切面的缺點(diǎn)。

本研究利用RT-PCR檢測(cè)pN0直腸癌患者淋巴結(jié)中GUCYG mRNA的表達(dá)情況，分析不同表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系。研究顯示淋巴結(jié)GCC mRNA陽(yáng)性表達(dá)組復(fù)發(fā)率與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較陰性組高，2年無(wú)瘤生存期較陰性組短，相同T分期患者淋巴結(jié)GCC mRNA表達(dá)陽(yáng)性組預(yù)后較陰性組差，其中T3～T4淋巴結(jié)GCC mRNA表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于T1～T2，但5年的無(wú)瘤生存期、總生存期及相關(guān)亞組分析還有待進(jìn)一步觀察；對(duì)于GCC mRNA陽(yáng)性表達(dá)者預(yù)后差，具體機(jī)制還有待探索，可能同GCC mRNA通過(guò)cGMP依賴(lài)的相關(guān)機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)大腸癌細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)[7-10]。

本研究提示GCC mRNA可作為淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的可靠指標(biāo)，對(duì)直腸癌的分子生物學(xué)分期以及預(yù)后判斷有指導(dǎo)意義，可為直腸癌的治療方案提供依據(jù)。

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[8] Nrimalya Basu，Sayanti Saha，Imran Khan，et al.Intestinal cell proliferation and senescence are regulated by receptor guanylyl cyclase C and p21[J].J Biol Chem，2014，289（1）：581-593.

[9] Bustin S A，Siddiqi S，Ahmed S，et al.Quantification of cytokeratin 20， carcinoembryonic antigen and guanylyl cyclase C mRNA levels in lymph nodes may not predict treatment failure in colorectal cancer patients[J].Int J Cancer，2004，108（3）：412-417.

[10] Bustin S A，Gyselman V G，Williams N S，et al.Detection of cytokeratins 19/20 and guanylyl cyclase C in peripheral blood of colorectal cancer patients[J].Br J Cancer，1999，79（11-12）：1813-1820.

（收稿日期：2014-03-23） （本文編輯：蔡元元）endprint

傳統(tǒng)的分期方法主要借助組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果，其局限主要體現(xiàn)在：（1）組織病理學(xué)檢查本身的敏感性低，其分辨率最高僅為從200個(gè)正常細(xì)胞中檢出1個(gè)腫瘤細(xì)胞；（2）僅能納入淋巴結(jié)的少量淋巴組織進(jìn)行分析，易遺漏腫瘤細(xì)胞；（3）僅能納入少數(shù)淋巴結(jié)進(jìn)行分析，易遺漏陽(yáng)性淋巴結(jié)；故pN0并不代表淋巴結(jié)沒(méi)有腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。GCC是受體鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶家族成員之一，人類(lèi)GUCYC基因定位于12號(hào)染色體，約85 kb，有27個(gè)外顯子，含3745 bp核苷酸序列[2]。GUCYG在正常小腸黏膜上皮細(xì)胞及原發(fā)或繼發(fā)性的結(jié)腸直腸惡性腫瘤中表達(dá)，是結(jié)腸直腸的高度特異性的生物學(xué)指標(biāo)[1-3]。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是RT-PCR技術(shù)的成熟和完善，其應(yīng)用于檢測(cè)隱匿性轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞已成為目前研究的熱點(diǎn)[4-6]。RT-PCR技術(shù)檢測(cè)隱匿性轉(zhuǎn)移的優(yōu)越性，從理論上分析，檢測(cè)轉(zhuǎn)移用測(cè)定mRNA的RT-PCR優(yōu)于測(cè)定蛋白質(zhì)的免疫學(xué)技術(shù)，因?yàn)椋海?）mRNA在細(xì)胞外很不穩(wěn)定，只要在組織或體液中測(cè)出特異性RNA，就意味著有腫瘤細(xì)胞的存在；（2）有些腫瘤細(xì)胞可轉(zhuǎn)錄組織特異性抗原的mRNA，但無(wú)該抗原蛋白合成；（3）RT-PCR相對(duì)免疫學(xué)技術(shù)易行，只要待測(cè)基因序列，即可設(shè)計(jì)引物作RT-PCR，而免疫學(xué)技術(shù)則需不斷生產(chǎn)特異性抗體；（4）很少量的癌細(xì)胞即可被檢出，可以檢出約106～107個(gè)正常細(xì)胞中夾雜的1個(gè)腫瘤細(xì)胞；（5）可以同時(shí)對(duì)大量標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)并且整個(gè)過(guò)程只需1～2 d；（6）提取整塊淋巴結(jié)組織的RNA進(jìn)行檢測(cè)，克服了傳統(tǒng)組織學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)方法只能切取數(shù)個(gè)淋巴結(jié)切面的缺點(diǎn)。

本研究利用RT-PCR檢測(cè)pN0直腸癌患者淋巴結(jié)中GUCYG mRNA的表達(dá)情況，分析不同表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系。研究顯示淋巴結(jié)GCC mRNA陽(yáng)性表達(dá)組復(fù)發(fā)率與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較陰性組高，2年無(wú)瘤生存期較陰性組短，相同T分期患者淋巴結(jié)GCC mRNA表達(dá)陽(yáng)性組預(yù)后較陰性組差，其中T3～T4淋巴結(jié)GCC mRNA表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于T1～T2，但5年的無(wú)瘤生存期、總生存期及相關(guān)亞組分析還有待進(jìn)一步觀察；對(duì)于GCC mRNA陽(yáng)性表達(dá)者預(yù)后差，具體機(jī)制還有待探索，可能同GCC mRNA通過(guò)cGMP依賴(lài)的相關(guān)機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)大腸癌細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)[7-10]。

本研究提示GCC mRNA可作為淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移的可靠指標(biāo)，對(duì)直腸癌的分子生物學(xué)分期以及預(yù)后判斷有指導(dǎo)意義，可為直腸癌的治療方案提供依據(jù)。

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（收稿日期：2014-03-23） （本文編輯：蔡元元）endprint