陳海迪 高旭 張穎 許應(yīng)天 張立媛 于清洋 魯承

摘要 [目的] 構(gòu)建表達(dá)鵝細(xì)小病毒（GPV）VP3基因的重組腺病毒，為機(jī)體免疫試驗(yàn)和免疫效果評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。[方法] 以重組質(zhì)粒pcDNA-VP3為模板，以GPV-VP3為目的基因，構(gòu)建GPV-VP3重組腺病毒載體，通過轉(zhuǎn)染獲得能穩(wěn)定表達(dá)GPV-VP3基因的重組腺病毒，通過IFA和Western-blot檢測(cè)GPV-VP3基因的表達(dá)情況。[結(jié)果] 擴(kuò)增到的GPV-VP3基因全長(zhǎng)為1 605 bp，線性化的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pCR259-VP3能在QBI-HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)GPV-VP3基因，表達(dá)蛋白的分子量約為60 Ku。[結(jié)論] 該重組腺病毒的構(gòu)建將為GPV新型疫苗研發(fā)和后期體內(nèi)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 鵝細(xì)小病毒;VP3基因;重組腺病毒;真核表達(dá)

中圖分類號(hào) S852.65+7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）33-11751-04

Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Expressing VP3 Gene of Goose Parvovirus

CHEN Hai-di， GAO Xu， ZHANG Ying et al

（Department of Veterinary Medicine， Agricultural College of Yanbian University， Yanji， Jilin 133002）

Abstract [Objective] The research aimed to construct recombinant adenovirus expressing VP3 gene of goose parvovirus and lay the foundation for making the immunity test and evaluating the immune effects. [Method] Taking recombinant plasmid pcDNA-VP3 as the template， using GPV-VP3 as target gene， the recombinant adenovirus vector of GPV-VP3 was constructed. The recombinant adenovirus that could stably express VP3 gene of goose parvovirus was obtained by transfection. The expression situations of GPV-VP3 were detected by IFA and Western-blot detection. [Result] The complete sequence of amplified GPV-VP3 gene was 1 605 bp. pCR259-VP3 plasmid could transiently express in QBI-HEK293 cells. And the molecular weight of recombinant protein was about 60 Ku. [Conclusion] The construction of recombinant adenovirus laid a foundation for the research and development of a new vaccine of GPV and its experiment in vivo.

Key words Goose parvovirus; VP3 gene; Recombinant adenovirus; Eukaryotic expression

基金項(xiàng)目 吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（201215230）。

作者簡(jiǎn)介 陳海迪（1988- ），女，吉林長(zhǎng)春人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物傳染病分子生物學(xué)與免疫學(xué)。*通訊作者，副教授，博士，從事動(dòng)物傳染病分子生物學(xué)與免疫學(xué)研究。

收稿日期 2014-10-15

鵝細(xì)小病毒?。℅oose parvovirusis，GP）是由鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV）引起的一種雛鵝和雛番鴨最急性、急性、亞急性及高度接觸性傳染病[1]。該病主要侵害雛鵝，病程短，雛鵝發(fā)病后多在1 d左右死亡，根本來不及治療，死亡率高，給養(yǎng)鵝業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。防治鵝細(xì)小病毒病，接種有效的疫苗是關(guān)鍵。目前，養(yǎng)鵝業(yè)大多采用傳統(tǒng)疫苗，但存在散毒和滅活不徹底等潛在危險(xiǎn)，而基因工程疫苗彌補(bǔ)了傳統(tǒng)疫苗的不足。在眾多基因工程疫苗中，由于活載體疫苗能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生持久的體液免疫，可長(zhǎng)期抵御外來病原體的侵襲，已成為當(dāng)今新型疫苗研究的熱點(diǎn)。在活載體疫苗中，腺病毒活載體疫苗因其安全性高、毒性小、宿主范圍廣等特點(diǎn)而受到了廣大科研人員的關(guān)注，相關(guān)腺病毒活載體疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)或商品化，并取得了很好的免疫保護(hù)效果和經(jīng)濟(jì)效益[3]。目前，尚未見到有關(guān)GPV重組腺病毒載體疫苗的報(bào)道。在GPV 3個(gè)結(jié)構(gòu)基因中，VP3基因編碼的衣殼蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，使其成為預(yù)防GP基因工程疫苗研究的首選靶基因。因此，筆者以改造的腺病毒為載體，以GPV-VP3為目的基因，構(gòu)建GPV-VP3重組腺病毒載體，通過轉(zhuǎn)染獲得能穩(wěn)定表達(dá)GPV-VP3基因的重組腺病毒，為下一步機(jī)體免疫試驗(yàn)和免疫效果評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和菌株

重組質(zhì)粒pcDNA-VP3由延邊大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存;E.coliJM109和DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司;QBI-HEK293細(xì)胞和腺病毒穿梭載體pCR259由日本帶廣畜產(chǎn)大學(xué)原蟲病中心玄學(xué)南教授惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

FITC標(biāo)記及HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，購(gòu)自Sigma公司。Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、各種限制性內(nèi)切酶、pMD19-T Simple Vector及DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等均購(gòu)自TaKaRa公司;Trizol試劑、Lipofecta mineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自invitrogen公司;其他常規(guī)生化試劑均為分析純。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中登錄的GPV-VP3基因序列（AY524421 ），應(yīng)用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)合成了1對(duì)特異引物，上游P1：5′-CTCGAGATGGCAGAGGGAGGAG -3′（Xho I），下游P2：5′-CGGTCGACTTACAGATTTTGAGTTAG-3′（Sal I），由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 GPV-VP3基因的克隆與鑒定

以重組質(zhì)粒pcDNA-VP3為模板，以P1與P2為引物，PCR反應(yīng)體系為50 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，55.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸100 s，30個(gè)循環(huán);最后72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-T Simple Vector，構(gòu)建質(zhì)粒pMD19T-VP3。將PCR和酶切鑒定均為陽(yáng)性的質(zhì)粒送往上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.5 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pCR259-VP3的構(gòu)建與鑒定

利用限制性內(nèi)切酶Sal I和Xhol I雙酶切陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pMD19T-VP3與腺病毒穿梭載體pCR259，各回收目的片段4 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選出陽(yáng)性克隆產(chǎn)物接種于Amp/LB，220 r/min，37 ℃過夜培養(yǎng)。將PCR和酶切鑒定均為陽(yáng)性的質(zhì)粒（pCR259-VP3）送往上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.6 重組腺病毒rAd-VP3的制備

經(jīng)Lipofectamine 2000介導(dǎo)，將測(cè)序正確的質(zhì)粒pCR259-VP3轉(zhuǎn)染到QBI-HEK293細(xì)胞，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，加入1.5 ml含8%血清的DMEM完全培養(yǎng)液過夜培養(yǎng)，此后在第1天和第5天更換含3%血清的DMEM完全培養(yǎng)液，經(jīng)過7～10 d培養(yǎng)至出現(xiàn)細(xì)胞病變后收獲病毒，即為原代重組腺病毒rAd-VP3，記為f0代。

1.7 rAd-VP3的RT-PCR鑒定

將f0代重組腺病毒rAd-VP3連續(xù)傳代，收集第f0、f2、f6、f10、f12代病毒，應(yīng)用Trizol試劑提取總RNA，以O(shè)ligo（dT）為隨機(jī)引物合成cDNA，利用P1、P2引物進(jìn)行RT-PCR鑒定。

1.8 IFA檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物 將收集的f0代重組腺病毒rAd-VP3接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的QBI-HEK293細(xì)胞，以野生型腺病毒感染QBI-HEK293細(xì)胞為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用預(yù)冷的丙酮固定10 min，以自制的兔抗GPV-VP3蛋白多克隆抗體為一抗，以FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.9 Western blot檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物

將收集的f0代重組腺病毒rAd-VP3接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的QBI-HEK293細(xì)胞，以野生型腺病毒感染QBI-HEK293細(xì)胞為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，經(jīng)-20 ℃反復(fù)凍融3次后，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，以自制的兔抗GPV-VP3蛋白多克隆抗體為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，DAB顯色后觀察結(jié)果。

1.10 重組腺病毒rAd-VP3 TCID50的測(cè)定

將QBI-HEK293細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)豐度達(dá)70%～80%時(shí)，將10倍倍比稀釋的F6代重組腺病毒rAd-VP3（共8個(gè)稀釋度：10-10～10-3）接種到96板中，每個(gè)稀釋度接種6個(gè)孔（100 μl/孔），并設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組，細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察并記錄病變情況，觀察6 d，通過Reed-Muench法計(jì)算重組病毒的TCID50。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增及克隆

從圖1可以看出，經(jīng)PCR擴(kuò)增的GPV-VP3基因長(zhǎng)度為1 605 bp，與預(yù)期大小相符，且測(cè)序結(jié)果正確。構(gòu)建的質(zhì)粒pMD19T-VP3經(jīng)Sal I和Xhol I雙酶切后，出現(xiàn)大小約為2 700 bp和1 605 bp的2個(gè)片段（圖2），結(jié)合測(cè)序結(jié)果，證明已成功構(gòu)建pMD19-VP3質(zhì)粒。

注：M：DL2 000 DNA Marker;1.GPV-VP3基因PCR產(chǎn)物。

圖1 GPV-VP3基因的PCR擴(kuò)增

注：M.DL2000 DNA Marker;1.GPV-VP3基因PCR鑒定結(jié)果;2.質(zhì)粒pMD19T-VP3的Xho l、Sal I雙酶切鑒定結(jié)果。

圖2 重組質(zhì)粒pMD19-VP3的鑒定

2.2 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pCR259-VP3的鑒定

限制性內(nèi)切酶Sal I和Xhol I雙酶切陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pMD19-VP3與腺病毒穿梭載體pCR259，將純化后的目的片段插入到腺病毒穿梭載體pCR259中，經(jīng)PCR擴(kuò)增出大小為1 605 bp的片段，與預(yù)期大小相符。將其質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)大小分別約為4 488 bp和1 605 bp的片段（圖3）。將質(zhì)粒送往北京英駿生物技術(shù)公司測(cè)序后證實(shí)，已成功構(gòu)建了重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pCR259-VP3。

注：M1.DL2 000 DNA Marker;M2.DL15 000 DNA Marker;1.GPV-VP3基因的PCR結(jié)果;2.重組質(zhì)粒pCR259-VP3的Xhol、Sal I雙酶切結(jié)果。

圖3 重組質(zhì)粒pCR259-VP3的鑒定

2.3 重組腺病毒rAd-VP3的制備及毒價(jià)測(cè)定

利用大量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)過Pac I線性化酶切、無水乙醇沉淀后，由Lipofecta mine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至QBI-HEK293細(xì)胞中，第8天開始細(xì)胞出現(xiàn)皺縮變圓、呈葡萄串狀、逐漸脫落等細(xì)胞病變（圖4），收獲病毒，即為f0代重組腺病毒rAd-VP3。收獲的f0代重組腺病毒rAd-VP3盲傳至F6代，經(jīng)Reed-Meunch方法計(jì)算rAd-VP3病毒滴度為109.15TCID50/ml。

注：A.重組腺病毒rAd-VP3導(dǎo)致QBI-HEK293細(xì)胞出現(xiàn)病變;B.正常QBI-HEK293細(xì)胞對(duì)照。

圖4 QBI-HEK 293細(xì)胞的病變

2.4 rAd-VP3的RT-PCR鑒定

感染rAd-VP3的QBI-HEK293細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，f0、f2、f6、f10、f12代均可見1 605 bp特異目的條帶，而空白對(duì)照組無特異條帶（圖5），表明rAd-VP3能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄。

注：M.DL2 000 DNA Marker;F0、 F2、F6、F10、F12：RT-PCR擴(kuò)增GPV-VP3基因轉(zhuǎn)錄結(jié)果;F：空白對(duì)照。

圖5 重組腺病毒rAd-VP3感染的QBI-HEK 293細(xì)胞的RT-PCR鑒定

2.5 IFA檢測(cè)重組VP3蛋白在QBI-HEK 293細(xì)胞中的表達(dá)

經(jīng)IFA檢測(cè)，在熒光顯微鏡下，接種f0代重組原病毒rAd-VP3的視野下有特異綠色熒光出現(xiàn)，而空白對(duì)照組的視野下沒有綠色熒光（圖6），說明f0代重組原病毒rAd-VP3能在QBI-HEK293細(xì)胞中表達(dá)GPV-VP3蛋白。

2.6 Western blot 分析

經(jīng)Western blot檢測(cè)，在f0代重組原病毒rAd-VP3感染的QBI-HEK293細(xì)胞裂解物中檢測(cè)到分子量為60 Ku的特異性條帶（圖7），而空白對(duì)照組未見條帶。結(jié)果表明，f0代重組原病毒rAd-VP3能在QBI-HEK293細(xì)胞中表達(dá)GPV-VP3蛋白。

3 討論

目前，隨著市場(chǎng)對(duì)鵝絨需求量的提升，養(yǎng)鵝業(yè)得到了迅

注：A.rAd-VP3在QBI-HEK293細(xì)胞中表達(dá)GPV-VP3蛋白;B.空白對(duì)照。

圖6 IFA檢測(cè)重組VP3蛋白在QBI-HEK 293細(xì)胞中的表達(dá)

注：M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)Marker;1.空白對(duì)照;2.rAd-VP3在QBI-HEK293細(xì)胞中表達(dá)GPV-VP3蛋白。

圖7 Western blot檢測(cè)重組VP3蛋白在QBI-HEK293細(xì)胞中的表達(dá)

猛發(fā)展。但是，隨著集約化和規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展以及流通速度加快，使鵝細(xì)小病毒病在我國(guó)不同地區(qū)出現(xiàn)暴發(fā)和流行，表現(xiàn)為大批雛鵝突然死亡，有的病死率高達(dá)100%[4]。由于該病主要發(fā)生于雛鵝群體，病程短，傳播速度快，死亡率高，使鵝細(xì)小病毒病成為危害我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)健康發(fā)展的最重要傳染病之一，給養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。近些年，由于地域的優(yōu)勢(shì)，延邊地區(qū)向韓國(guó)和日本的鵝絨出口量在穩(wěn)步上升，該地區(qū)對(duì)鵝絨的需求量也在上升，這就催生了養(yǎng)鵝業(yè)的快速發(fā)展，但隨著鵝細(xì)小病毒病的發(fā)生和流行，嚴(yán)重制約了該地區(qū)養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展，應(yīng)該研制出一種安全、有效的疫苗進(jìn)行免疫接種，遏制鵝細(xì)小病毒病的傳播和蔓延。

從20世紀(jì)70年代中期開始，分子生物學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展，使從事疫苗研究的科學(xué)家得以從分子水平對(duì)病原體的基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，用重組DNA技術(shù)研制的新型基因工程疫苗除了能保證其同傳統(tǒng)疫苗具有同樣的免疫原性外，最大的優(yōu)越性是安全性高和經(jīng)濟(jì)效益好，避免了傳統(tǒng)疫苗毒力返強(qiáng)、滅活不徹底等潛在危險(xiǎn)，同時(shí)也具有易于區(qū)分免疫和自然感染的優(yōu)點(diǎn)。在鵝細(xì)小病毒病結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3）中，衣殼蛋白VP3是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占總衣殼蛋白含量的80%，且暴露于病毒粒子表面，是病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體的重要抗原蛋白，所以VP3基因是研制基因工程疫苗的首選基因[6]。車茜等[7]通過基因槍轟擊，將VP3基因疫苗（pcDNAGPV-VP3）接種免疫雛鵝，所誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫的能力明顯強(qiáng)于弱毒疫苗。許洪潔等[8]將真核表達(dá)質(zhì)粒（pVAXI-GPV-VP3）免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)真核表達(dá)載體疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的體液免疫，但細(xì)胞免疫水平不顯著。盧菲等[9]對(duì)GPV-VP3基因疫苗與弱毒疫苗進(jìn)行了比較研究，對(duì)于GPV-VP3基因疫苗的免疫效力有不同的評(píng)價(jià)結(jié)果。高旭等[10]構(gòu)建了包含GPV-VP3基因的VP2基因工程亞單位疫苗，免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后可產(chǎn)生較高的抗體水平，短期免疫效果明顯，但不能持久產(chǎn)生抗體，不能誘導(dǎo)持久的體液免疫和細(xì)胞免疫水平，這是不能回避的關(guān)鍵問題?；钶d體疫苗解決了此難題，活病毒載體不僅失去了致病性，而且還能在免疫機(jī)體內(nèi)持續(xù)表達(dá)外源保護(hù)性抗原基因，兼有滅活疫苗和活疫苗的優(yōu)點(diǎn)。在諸多的活病毒載體中，經(jīng)過改造后的腺病毒安全性高、毒性低、宿主范圍廣，能同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生B細(xì)胞免疫和T細(xì)胞免疫反應(yīng)，已成為目前最有應(yīng)用前景的疫苗載體之一，被廣泛應(yīng)用于各種預(yù)防性或治療性疫苗的研發(fā)，如HIV、流感、乙肝、狂犬病等疾病的腺病毒載體疫苗，并取得了可喜的效果[3]。但關(guān)于腺病毒載體用于鵝細(xì)小病毒方面的研究尚未見報(bào)道，所以這方面的研究與開發(fā)將有很大的空間和前景。

該研究以前期分離的YBLJ株GPV強(qiáng)毒[11]為毒種，克隆能產(chǎn)生中和抗體的VP3基因，所構(gòu)建的腺病毒載體疫苗具有顯著的地域性和針對(duì)性，對(duì)預(yù)防延邊地區(qū)鵝細(xì)小病毒病發(fā)生和凈化鵝細(xì)小病毒將具有重要意義。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然GPV-VP3基因較長(zhǎng)（1 605 bp），但在Lipofecta mine2000的介導(dǎo)下線性化的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pCR259-VP3能在QBI-HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)GPV-VP3蛋白，通過IFA和Western blot檢測(cè)，蛋白表達(dá)量較高，再次證實(shí)GPV-VP3腺病毒載體疫苗研制的可行性，隨著下一步體內(nèi)免疫試驗(yàn)的開展，將驗(yàn)證該活載體疫苗的免疫效力和免疫機(jī)制，為GPV新型疫苗研發(fā)以及探討腺病毒載體應(yīng)用于鵝細(xì)小病毒病預(yù)防的前景奠定基礎(chǔ)，進(jìn)一步促進(jìn)養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展。

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