劉芬 江榕 李勇 曾振國 聶成 趙寧 黃彩雪 夏亮 錢克儉

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.08.010

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81101410，81160233）；江西省自然科學(xué)基金（20122BAB205002）

作者單位：330006 南昌，南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（劉芬、江榕、曾振國、聶成、趙寧、黃彩雪、夏亮、錢克儉），腫瘤科（李勇）

通信作者：錢克儉，Email： qkj0607@sohu.com

【摘要】目的 觀察脂多糖 （lipopolysaccharide， LPS） 刺激大鼠肺泡巨噬細胞NR8383后乙酰膽堿酯酶 （acetylcholinesterase， AChE） 的表達變化，為研究膽堿能抗炎通路的調(diào)控提供新的實驗依據(jù)。

訪法 將體外去致熱源培養(yǎng)的NR8383細胞分為對照組及LPS （1 μg/mL） 刺激組，于刺激后3、6、12、24 h各時間點分別離心收集上清液及細胞沉淀，采用酶聯(lián)免疫吸附法 （enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA） 測定上清液中腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α， TNF-α） 的變化，實時定量PCR檢測細胞中AChE mRNA的表達改變，蛋白質(zhì)免疫印跡法 （Western blot） 檢測細胞中AChE蛋白的表達變化，乙酰膽堿酯酶T-CHE測試盒檢測上清液中AChE活性的變化。組間多重比較采用單因素方差分析，進一步采用LSD-t檢驗進行兩兩比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果 與對照組相比，TNF-α的含量在LPS刺激NR8383細胞后3 h開始顯著上升 （P<0.05），12 h達高峰，24 h下降但仍明顯高于對照組水平 （P<0.05）。與對照組相比，AChE mRNA于刺激后3 h開始上升，升高（3.19 ± 0.44）倍（P<0.05），6 h后達高水平并維持于此水平，6、12、24 h分別上調(diào)[（5.65 ± 0.63）、（5.40 ± 0.71）、（5.35 ± 0.77）[倍（與對照組相比，均P<0.05）；AChE蛋白的表達及上清液中AChE的活性在LPS刺激后12 h與各自對照組相比均上升[AChE蛋白：（1.37 ± 0.01） vs.（1.05 ± 0.02），P<0.05；AChE活性：（6.14 ± 1.13） U/mL vs. （2.64 ± 0.85） U/mL，P<0.05]，隨后呈下降趨勢，于LPS作用24 h時均低于各自對照組[AChE蛋白：0.65 ± 0.05，P<0.05，AChE活性：（0.56 ± 0.19 ）U/mL，P<0.05]。

結(jié)論 LPS刺激大鼠肺泡巨噬細胞后，AChE的表達增加，提示其可能參與肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控；LPS刺激后24 h，AChE mRNA仍處于高表達水平，AChE蛋白及活性卻下降，提示在肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)中可能存在AChE轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。

【關(guān)鍵詞】乙酰膽堿酯酶；脂多糖；肺泡巨噬細胞；炎癥反應(yīng)；膿毒癥

Changes of acetylcholinesterase expression in alveolar macrophages stimulated by lipopolysaccharide Liu Fen， Jiang Rong， Li Yong， Zeng Zhenguo， Nie Cheng， Zhao Ning， Huang Caixue， Xia Liang， Qian Kejian. Department of Critical Care Medicine， the First Affiliated Hospital of Nanchang University， Nanchang 330006， China

Corresponding author： Qian Kejian， Email： qkj0607@sohu.com

【Abstract】Objective To observe the changes of acetylcholinesterase （AChE） in rat alveolar macrophages NR8383 stimulated by lipopolysaccharide （LPS） in order to provide a novel experimental evidence for studying the regulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway.Methods The NR8383 cells cultured with pyrogen-free in vitro were divided into control group and LPS （1 μg/mL） stimulation group. Culture supernatants and cell pellets were collected by centrifugation at 3 h， 6 h， 12 h and 24 h after stimulation， respectively. The level of tumor necrosis factor-α （TNF-α） in the supernatant was assayed by using enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The expression of AChE mRNA in cells was detected by using real time quantitative RT-PCR， The level of AChE protein in cells was analyzed by using Western blot， The activity of AChE in the supernatant was measured by using True Choline esterase assay kit （T-CHE）. One-way analysis of variance （ANOVA） was used for comparisons between two groups， and LSD-t test was performed for further comparison， and difference was statistically significant at P < 0.05. Results The level of TNF-α began to increased significantly at 3 h after stimulation of NR8383 cells with LPS （P<0.05） compared with control group， and reached its peak at 12 h， then decreased until 24 h but the level was still significantly higher than that in control group （P<0.05）； The expression of AChE mRNA began to elevate at 3 h after stimulation compared with control group [ （3.19 ± 0.44） times， P<0.05 ]， at 6 h reached the high level and then maintained this level at 12 h and 24 h [ （5.65 ± 0.63）， （5.40 ± 0.71）， （5.35 ± 0.77） times， compared with control group， all P<0.05 ]； The level of AChE protein in cells and the activity of AChE in the supernatant increased at 12 h after LPS stimulation compared with control group [AChE protein： （1.37 ± 0.01） vs. （1.05 ± 0.02）， P<0.05； AChE activity：（ 6.14 ± 1.13） U/ml vs. （2.64 ± 0.85） U/ml， P<0.05]， followed by a downward trend， and were lower than those in control groups at 24 h after LPS stimulation [AChE protein： （0.65 ± 0.05）， P<0.05； AChE activity： （0.56 ± 0.19） U/ml， P<0.05].Conclusions The expression of AChE mRNA increased after stimulation with LPS in rat alveolar macrophages， suggesting that AChE may be involved in regulation of alveolar macrophages inflammatory response； AChE mRNA expression is still high while its protein and activity are declined at 24 h after LPS stimulation， suggesting that there may be some mechanisms existed in post-transcriptional regulation of AChE in alveolar macrophages during inflammatory response.

【Key words】Acetylcholinesterase； Lipopolysaccharide； Alveolar macrophage； Inflammatory response； Sepsis

乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase， AChE）是一種特異性催化水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿 （acetylcholine， ACh）的酶^[1]。最近有研究表明炎癥反應(yīng)時迷走神經(jīng)末梢通過釋放ACh可與巨噬細胞上的α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor， α7nAChR）相互作用，減少腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）等促炎因子的釋放，形成一條膽堿能抗炎通路調(diào)控炎癥反應(yīng)^[2-3]。AChE因其水解抗炎介質(zhì)ACh的作用，成為研究炎癥反應(yīng)的新靶點。但AChE在肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)中的表達變化未見文獻報道。本研究以脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）刺激大鼠肺泡巨噬細胞為炎癥反應(yīng)模型，觀察并分析炎癥反應(yīng)時AChE在肺泡巨噬細胞中的表達變化，為研究膽堿能抗炎通路的調(diào)控提供新的實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

大鼠肺泡巨噬細胞株（NR8383）購自中國科學(xué)院細胞庫；Hams F-12K培養(yǎng)基、LPS（E. coli， O111： B4）購自美國Sigma-Aldrich；胎牛血清購自美國Gibco；大鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒購自上海森雄科技實業(yè)有限公司；TRIzol、實時定量PCR引物購自美國Invitrogen；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR實時熒光定量試劑盒購自大連TaKaRa；山羊抗大鼠乙酰膽堿酯酶多克隆抗體購自美國abcam；小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體購自美國anbo；辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；乙酰膽堿酯酶T-CHE測試盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2細胞培養(yǎng)

所用細胞培養(yǎng)物品均行去致熱源處理。將大鼠肺泡巨噬細胞NR8383培養(yǎng)于含15%去致熱源胎牛血清的Hams F-12K完全培養(yǎng)基中，置于大氣壓下37 ℃、5% CO₂的恒溫濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細胞融合至80%以上時進行傳代。

1.3 實驗分組及處理

將NR8383細胞按1×10⁶個/mL密度接種于六孔板中，每孔2 mL。實驗分為對照組及LPS刺激組，將終質(zhì)量濃度1 μg/mL的LPS加至LPS刺激組培養(yǎng)基中，于刺激后3、6、12、24 h各時間點分別離心收集上清液及細胞沉淀，上清液用于TNF-α及AChE活性檢測，細胞沉淀用于提取總RNA及總蛋白。

1.4 肺泡巨噬細胞上清液中TNF-α蛋白濃度的檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定上清液中TNF-α質(zhì)量濃度，遵照ELISA試劑盒檢測說明書進行操作。

1.5 肺泡巨噬細胞中AChE mRNA表達的檢測

采用TRIzol試劑提取細胞總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提的總RNA質(zhì)量，紫外分光光度計測定總RNA在260 nm和280 nm處光密度值，以確定濃度及純度。參照PrimeScriptRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，10 mL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。參照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒說明書進行實時定量PCR反應(yīng)，20 mL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。在ABI StepOne定量PCR儀上進行擴增反應(yīng)，選取β-actin作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt 方法計算AChE mRNA的相對表達量。

1.6 肺泡巨噬細胞中AChE蛋白表達的檢測

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）檢測AChE蛋白表達。細胞經(jīng)RIPA試劑冰上裂解后提取總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度，加入2×上樣緩沖液后沸水中水浴變性5～10 min。各取20 μg/孔，進行10% SDS-PAGE垂直凝膠電泳分離（濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V），隨后電轉(zhuǎn)移至NC膜上（電流100 mA，時間1.5 h）。5% 脫脂奶粉封閉1 h，一抗（山羊抗大鼠AChE抗體1∶200，小鼠抗大鼠β-actin抗體1∶3000）4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（兔抗山羊1∶10 000，山羊抗小鼠1∶3000）室溫孵育1 h，TBST洗膜后，滴加免疫熒光化學(xué)發(fā)光法發(fā)光底物，曝光，顯影。以β-actin為內(nèi)參照，分析條帶灰度值。

1.7 肺泡巨噬細胞上清液中AChE活性的檢測

收集上清液按乙酰膽堿酯酶T-CHE測試盒操作說明書進行反應(yīng)測定，AchE活性 （U/mL）=（測定管OD值-對照管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度 （1 μmol / mL） ×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，不同時間點多個均數(shù)多重比較采用單因素方差分析，若差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，不同時間點均數(shù)兩兩比較則進一步采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺泡巨噬細胞上清液中TNF-α的濃度變化

LPS（1 μg/mL）刺激NR8383細胞后，通過ELISA檢測上清液中TNF-α的變化，結(jié)果顯示，與對照組相比，TNF-α的含量在LPS刺激后3 h開始顯著上升（P<0.05），12 h達高峰，24 h下降但仍明顯高于對照組水平（P<0.05）。見圖1。

2.2 肺泡巨噬細胞中AChE mRNA的表達變化

LPS（1 μg/mL）刺激NR8383細胞后，采用實時定量PCR方法檢測AChE mRNA的相對表達變化，結(jié)果顯示，在LPS刺激后3 h、6 h、12 h、24 h，AChE mRNA的表達水平與正常對照組相比分別上調(diào)（3.19 ± 0.44）倍（P<0.05），（5.65 ± 0.63）倍（P<0.05），（5.40 ± 0.71）倍（P<0.05），（5.35 ± 0.77）倍（P<0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；6 h、12 h、24 h三組間均數(shù)兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明LPS刺激能增加大鼠肺泡巨噬細胞NR8383中AChE mRNA的表達，于刺激后3 h開始上升，6 h后達高水平并維持于此水平。見圖2。

2.3 肺泡巨噬細胞中AChE蛋白的表達變化

LPS（1 μg/mL）刺激NR8383后12 h、24 h，對細胞AChE蛋白采用Western blot方法進行分析，結(jié)果如圖3A所示，在LPS刺激后12 h，AChE 蛋白條帶比對照組條帶增粗，顏色加深；在LPS刺激后24 h，與對照組相比，AChE 蛋白條帶變細，顏色變淺。條帶經(jīng)灰度值分析，AChE/β-actin灰度比值結(jié)果如圖3B所示，對照組、LPS 12 h、LPS 24 h灰度比值分別為（1.05 ± 0.02），（1.37 ± 0.01），（0.65 ± 0.05） ，P<0.05；12 h、24 h均值與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。LPS刺激大鼠肺泡巨噬細胞NR8383后，細胞中AChE蛋白的表達在刺激后12 h上升，隨后呈下降趨勢，于LPS作用后24 h低于對照組水平。見圖3。

2.4 肺泡巨噬細胞上清液中AChE活性的變化

LPS（1 μg/mL）LPS刺激NR8383后12 h、24 h，通過乙酰膽堿酯酶T-CHE測試盒對細胞上清液AChE活性進行測定，結(jié)果顯示，對照組AChE活性為（2.64 ± 0.85 ）U/mL，LPS刺激后12 h AChE活性為（6.14 ± 1.13 ）U/mL （P<0.05），刺激后24 h為（0.56 ± 0.19 ）U/mL （P<0.05），12 h、24 h均值與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明LPS刺激大鼠肺泡巨噬細胞NR8383后，細胞上清液中AChE的活性在刺激后12 h上升，隨后呈下降趨勢，于LPS作用后24 h低于對照組水平。見圖4。

3 討論

LPS是革蘭氏陰性菌外壁的主要成分，它可以通過作用肺內(nèi)巨噬細胞表面Toll樣受體4（Toll-like receptor 4， TLR4），依次磷酸化一系列蛋白激酶，最終活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor kappa B， NF-κB），引起多種炎癥因子如TNF-α基因轉(zhuǎn)錄，啟動炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致膿毒癥肺損傷，甚至急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome， ARDS）發(fā)生^[4-6]。本研究結(jié)果顯示LPS刺激大鼠肺泡巨噬細胞后TNF-α大量釋放，表明成功誘導(dǎo)肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)模型。堿能抗炎通路是一條神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)通路，由傳出迷走神經(jīng)、神經(jīng)遞質(zhì)ACh和α7nAChR組成，炎癥反應(yīng)時迷走神經(jīng)釋放的ACh與巨噬細胞上α7nAChR 結(jié)合，通過細胞內(nèi)信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻礙NF-κB的活化，抑制促炎因子釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)^[7]。在內(nèi)毒素血癥、膿毒癥休克、缺血-再灌注損傷等均有研究表明膽堿能抗炎通路發(fā)揮著重要的作用^[8-9]。Sun等^[10]研究發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞和小鼠中，膽堿能激動劑尼古丁通過上調(diào)miR-124的表達水平，降低白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）等炎癥因子的表達。AChE是一種特異性水解ACh的酶，它不僅存在于神經(jīng)元細胞中，也存在于免疫細胞上，其中巨噬細胞表達最豐富^[11]。炎癥反應(yīng)時巨噬細胞分泌的AChE將迅速水解ACh，阻礙ACh的抗炎作用，因此AChE成為調(diào)控炎癥反應(yīng)的新靶點。研究表明使用膽堿酯酶抑制劑可減輕膿毒癥動物炎癥反應(yīng)，如膽堿酯酶抑制劑加蘭他敏可通過抑制中樞AChE活性，降低LPS動物模型的血清TNF-α和IL-6水平及提高生存率^[12]。另外有研究發(fā)現(xiàn)血清膽堿酯酶可能參與了老年人全身炎癥反應(yīng)綜合征的發(fā)生和發(fā)展過程，并且對該類患者的預(yù)后有一定的預(yù)測作用^[13]。但膽堿能抗炎通路在ARDS中的調(diào)控作用及機制尚不確定。

本研究中，通過檢測對照組AChE mRNA、蛋白的表達及AChE活性均證實AChE在大鼠肺泡巨噬細胞中存在表達。更為重要的是，本研究觀察到LPS刺激肺泡巨噬細胞后12 h，AChE mRNA、蛋白及活性均較對照組升高，這說明LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)能引起AChE的表達增加，提示其可能參與肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控；刺激后24 h，AChE mRNA仍處于高表達水平，但AChE蛋白及活性均低于對照組，這與de Oliveira等^[14]對人急性白血病單核細胞細胞株（the human acute leukaemia monocytyc cell line， THP-1）的研究結(jié)果一致，提示在肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)中可能存在AChE轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。

轉(zhuǎn)錄后調(diào)控通常是由成熟mRNA的5或3 端非翻譯區(qū)（untranslated region， UTR）與相應(yīng)蛋白或microRNA等相互作用，介導(dǎo)mRNA的出核轉(zhuǎn)運、翻譯起始及降解等過程，從而調(diào)節(jié)基因的表達。近來有研究^[15-16]對小鼠和人初級巨噬細胞的研究發(fā)現(xiàn)AChE是miR-132的靶基因，miR-132能靶向作用AChE mRNA的3UTR，抑制AChE蛋白翻譯表達，加強膽堿能抗炎通路作用從而使炎癥消退。筆者的前期研究表明LPS刺激肺泡巨噬細胞能引起miR-132表達上調(diào)。因此筆者推測肺泡巨噬細胞中AChE轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控可能與miR-132有關(guān)，但仍有待今后進一步實驗證實。

參考文獻

[1]Meshorer E， Soreq H. Virtues and woes of AChE alternative splicing in stress-related neuropathologies [J]. Trends Neurosci， 2006， 29（4）： 216-224.

[2]Wang H， Yu M， Ochani M， et al. Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation [J]. Nature， 2003， 421（6921）： 384-388.

[3]Tracey KJ. Physiology and immunology of the cholinergic antiinflammatory pathway [J]. J Clin Invest， 2007， 117（2）： 289-296.

[4]Guha M， Mackman N. LPS induction of gene expression in human monocytes [J]. Cell Signal， 2001， 13（2）： 85-94.

[5]Salomao R， Brunialti MK， Rapozo MM， et al. Bacterial sensing， cell signaling， and modulation of the immune response during sepsis [J]. Shock， 2012， 38（3）： 227-242.

[6]黃日紅， 萬獻堯. 烏司他丁對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠肺組織Toll樣受體4信號通路表達的影響 [J]. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志， 2012， 21（11）： 1226-1229.

[7]Parrish WR， Rosas-Ballina M， Gallowitsch-Puerta M， et al. Modulation of TNF release by choline requires alpha7 subunit nicotinic acetylcholine receptor-mediated signaling [J]. Mol Med， 2008， 14（9-10）： 567-574.

[8]馬岳峰， 徐正寬， 劉志海. 重視膽堿能抗炎通路的研究 [J]. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志， 2009， 18（10）： 1016-1019.

[9]李輝， 劉志海， 馬岳峰. 膽堿酯酶抑制劑用于膿毒癥治療的研究進展 [J]. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志， 2010， 19（12）： 1336-1338.

[10]Sun Y， Li Q， Gui H， et al. MicroRNA-124 mediates the cholinergic anti-inflammatory action through inhibiting the production of pro-inflammatory cytokines [J]. Cell Res， 2013， 23 （11）： 1270-1283.

[11]王金榮， 王宏偉， 劉勝洪， 等. 大鼠免疫細胞及器官的固有膽堿能系統(tǒng) [J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志， 2005， 4（1）： 28-31.

[12]Pavlov VA， Parrish WR， Rosas-Ballina M， et al. Brain acetylcholinesterase activity controls systemic cytokine levels through the cholinergic anti-inflammatory pathway [J]. Brain Behav Immun， 2009， 23（1）： 41-45.

[13]李天瑯， 金啟輝， 陳懷紅. 血清膽堿酯酶對老年全身炎癥反應(yīng)綜合征患者預(yù)后的預(yù)測作用 [J]. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志， 2011， 20（7）： 730-733.

[14]de Oliveira P， Gomes AQ， Pacheco TR， et al. Cell-specific regulation of acetylcholinesterase expression under inflammatory conditions [J]. Clin Hemorheol Microcirc， 2012， 51（2）： 129-137.

[15]Shaked I， Meerson A， Wolf Y， et al. MicroRNA-132 potentiates cholinergic anti-inflammatory signaling by targeting acetylcholinesterase [J]. Immunity， 2009， 31（6）： 965-973.

[16]Shaltiel G， Hanan M， Wolf Y， et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target [J]. Brain Struct Funct， 2013， 218（1）： 59-72.

（收稿日期：2014-02-18）

（本文編輯：何小軍）

P871-875