陳 鑫，趙彬彬，武 婧，彭婉君，牛 棟，韓云林，王欣佩，張伶燕，劉江寧

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，國家衛(wèi)健委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術(shù)研究中心，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

手足口病(hand, foot and mouth disease， HFMD)是由多種腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病，腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是引起HFMD的主要病原體之一。輕度感染者可在手足口等部位出現(xiàn)皰疹、斑丘疹等癥狀；重癥患兒可造成腦干腦炎、無菌性腦膜炎、神經(jīng)源性肺水腫等并發(fā)癥，具有較高的致殘率和死亡率[1-2]。HFMD被稱為21世紀(jì)的“脊髓灰質(zhì)炎”，頗受醫(yī)學(xué)界關(guān)注。2008年5月至2011年12月期間，中國大陸地區(qū)手足口病發(fā)病例數(shù)為500多萬例，其中死亡1870例，且呈逐年增加態(tài)勢[3]。

目前手足口病致病相關(guān)基因的報道主要分為三類，病毒特異性受體類、宿主免疫反應(yīng)類和宿主病理損傷類[4]。但是，病毒特異性受體類中除SCARB2和PSGL-1較為明確以外，其它受體的相關(guān)研究較少。同樣，宿主病理損傷類中細胞凋亡和細胞自噬與手足口病致病機制的相關(guān)研究處于初期階段，需要進一步的深入研究。目前應(yīng)用于手足口病的動物模型主要是單一遺傳背景的小鼠包括特定轉(zhuǎn)基因、基因敲除的小鼠，以研究某一單一基因?qū)υ摬〉挠绊?。然而大部分的疾病都是非單基因疾病，除了受外界環(huán)境因素的影響，一般受多遺傳因素控制，而單一遺傳背景的小鼠無法模擬多基因疾病。

2002年國際復(fù)雜性狀聯(lián)盟(Complex Trait Consortium， CTC)的科學(xué)家們設(shè)計建立遺傳多樣性小鼠資源。通過對現(xiàn)有的小鼠近交品系進行進化關(guān)系的分析，科學(xué)家選出了8種小鼠品系作為遺傳多樣性小鼠的原始親本(founder): A/J，C57BL /6 J、129S1Sv /ImJ、NOD/ShiLtJ、NZO/H1LtJ、CAST /EiJ、PWK/PhJ 和WSB /EiJ。其中前5個品系是實驗室常用的純系小鼠，后3個是野生型小鼠。它們的遺傳物質(zhì)的多樣性基本可以覆蓋小鼠整個物種，由于這8個品系的親緣關(guān)系相對較遠，可以保證遺傳多樣性小鼠品系遺傳位點的分散性。遺傳多樣性小鼠與傳統(tǒng)的單一背景的小鼠最大的差異是它們可以進行復(fù)雜數(shù)量性狀位點的確認，用于復(fù)雜性狀的研究[5-7]。在本文中我們將通過遺傳多樣性小鼠資源，比對遺傳多樣性小鼠的系統(tǒng)遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫The GeneMine[8]，篩選與 EV71病毒敏感性及疾病重癥程度相關(guān)的基因簇，并將這些發(fā)現(xiàn)迅速應(yīng)用于候選治療方法和疫苗的開發(fā)，為以EV71為主要病原體的手足口病的預(yù)防、控制、治療和預(yù)后提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

SPF級4～6周齡C57BL /6小鼠28只，雌雄各半，體重18～22 g，購自北京華阜康實驗動物技術(shù)有限[SCXK(京)2014-0008]；25個品系的清潔級遺傳多樣性小鼠共計140只，雌雄各半，體重9～25 g，4～6周齡，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所北方中心[SCXK(京)2014-0011]提供。實驗在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所動物生物安全二級實驗室(ABSL-2)進行。實驗動物的使用堅持3R原則，并得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用和管理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號: LJN18001)。動物在感染3d前進入ABSL-2適應(yīng)環(huán)境。

感染實驗所用病毒為本實驗室利用EV71病毒FY0805病毒株所獲得的小鼠傳代適應(yīng)株MP10(Accession number:HQ712020)，儲存病毒載量為108copies/mL。

1.2 主要試劑與儀器

普通PCR儀(PCR Master Cycler Gradient，Eppendorf，德國)；Nano-Zoomer S60 熒光切片掃描儀(日本)；超低溫冰箱(三洋，日本)；低溫髙速離心機(BECKMAN，美國)，臺式離心機(上海安亭離心機廠，中國)；實時熒光定量PCR儀Step One Plus(ABI,美國)；電子天平(上海民橋電子天平廠，中國)等。Trizol試劑(Life Technologies，美國);cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific，美國)；實時熒光定量檢測染料(Takara，日本)；10%福爾馬林中性固定液(南昌雨露實驗器材有限公司，中國)；75%醫(yī)用消毒酒精(北京貞玉民生藥業(yè)有限公司，中國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

A組：25個品系遺傳多樣性小鼠(表1)，B組： C57BL /6感染對照組(Negative Control，NC)，C組： C57BL /6空白對照組。每組動物4～6只。

1.3.2 動物感染和取材

用載量為1.0×108copies/mL的MP10毒株每只100 μL腹腔感染A組遺傳多樣性小鼠和B組C57BL /6小鼠，C組小鼠注射同等劑量的PBS作對照。感染3 d后，內(nèi)眥靜脈叢處取血約每只100 μL并置于1 mL的Trizol裂解液中用于后續(xù)核酸提取和病毒載量的檢測，感染5 d后取血每只100 μL并置于1 mL的Trizol裂解液中，脫頸椎處死取雙后肢骨骼肌，一份置于Trizol裂解液中用于提取核酸進行病毒載量的檢測，另一份置于10%福爾馬林中性固定液中用于病理切片分析。

表1 動物組別表Table 1 Animal groups

1.3.3 組織病毒載量檢測

取約50 mg左右后肢骨骼肌置于1 mL的Trizol裂解液中，用一次性研磨棒研磨勻漿，提取肌肉組織全RNA，然后用隨機引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，最后用實時定量熒光PCR技術(shù)進行病毒載量的測定[9-10]。

1.3.4 組織病理分析

后肢骨骼肌組織置于10%中性甲醛固定液中固定72 h，修塊，經(jīng)梯度酒精脫水后并進行石蠟包埋，切片厚度為5 μm，進行HE染色，染色完成后在顯微鏡下觀察組織病變情況。

2 結(jié)果

2.1 血液和組織病毒載量分析

本研究中共有25個不同品系的遺傳多樣性小鼠用于檢測感染EV71病毒3天后血液中的病毒載量，其中有7個品系小鼠的血液病毒載量在104copies/μL以上，相較于陰性對照組小鼠，更易被EV71病毒感染，歸為易感小鼠品系，分別是FEW、DAVIS、BOM、LAM、 POH、 LIV、PWK。其它病毒載量在104copies/μL以下的品系，與陰性對照組相比差異不顯著，歸為不易感小鼠品系結(jié)果見圖1 A。而在感染第5天，除PWK品系小鼠血液中依然維持較高的病毒水平外，其余品系血液中的病毒下降至較低水平(見圖1B)。此外，由于EV71病毒屬于神經(jīng)性病毒，可引起小鼠四肢麻痹癱瘓，為此研究人員檢測了小鼠后肢骨骼肌病毒載量，發(fā)現(xiàn)在感染第3天，F(xiàn)EW、DAVIS、BOM、LAM 4個品系小鼠的骨骼肌中病毒載量同樣維持在104copies/μL以上，與血液中的水平一致(見圖1C)。但在感染第5天，該7個品系骨骼肌中的病毒均下降至較低水平(見圖1D)。

綜上所述，遺傳多樣性小鼠在感染EV71病毒后表現(xiàn)出明顯的差異性，7個品系(FEW、DAVIS、BOM、LAM、POH、LIV、PWK)具有更強的易感性，可建立非基因修飾的易感小鼠模型。此外，由于EV71病毒屬于兒童手足口病病原體之一，只能在兒童中致病，在成人中不具致病性，成人只攜帶病毒但不發(fā)病，這與成年人完善成熟的免疫系統(tǒng)有關(guān)，該現(xiàn)象在小鼠中同樣適用。因此雖然EV71感染遺傳多樣性小鼠后在第3天大量增殖，但4～6周齡小鼠免疫系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)育成熟，病毒在第5天時便很快被小鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)清除。

2.2 感染小鼠的組織病理變化

通過組織病理分析，發(fā)現(xiàn)EV71易感的遺傳多樣性小鼠感染3天后，后肢骨骼肌會出現(xiàn)明顯的病理性損傷，主要表現(xiàn)為骨骼肌細胞萎縮或變性、間質(zhì)炎細胞浸潤或間質(zhì)水腫、肌細胞壞死等。圖2A為易感品系POH小鼠感染EV71后出現(xiàn)局灶性肌細胞變性壞死、炎細胞浸潤。而不易感品系和陰性對照的病理性損傷明顯較弱。圖2B為EV71不易感品系SAT感染EV71后出現(xiàn)肌肉間質(zhì)少量炎細胞浸潤。圖2C為空白對照組小鼠C57BL/6品系正常肌肉細胞。

由此可見，EV71易感品系在感染EV71后表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的病理損傷，但是由于成年小鼠具有完善的免疫系統(tǒng)，可以迅速將EV71病毒清除，因此病理損傷程度弱于乳鼠的損傷情況，也未觀察到明顯的臨床癥狀。

注: A：25個品系感染EV71后3天血液病毒載量。B：7個易感品系感染EV71后5天后血液病毒載量。 C：5個易感品系感染EV71后3天肌肉病毒載量。D：7個易感品系感染EV71后5天后肌肉病毒載量。NC：陰性對照。圖1 遺傳多樣性小鼠不同品系血液和肌肉的病毒載量Note. A: Blood viral load of 25 strains 3 days after challenged with EV71. B: Blood viral load of 7 strains 5 days after challenged with EV71. C: Muscle viral load of 5 strains 3 days after challenged with EV71. D: Muscle viral load of 5 strains 5 days after challenged with EV71. NC: Negative control.Figure 1 Viral load of blood and muscle of different strains of the genetic diversity mice

注: A：易感遺傳多樣性小鼠POH品系骨骼??； B：不易感遺傳多樣性小鼠SAT品系骨骼肌C：空白對照組C57BL /6品系骨骼肌。圖2 遺傳多樣性小鼠肌肉組織病理改變Note. A, Skeletal muscle of susceptible genetic diversity mouse POH strain; B, Skeletal muscle of less susceptible genetic diversity mouse SAT strain；C, Skeletal muscle of blank control group C57BL /6 strain.Figure 2 Pathological changes in the muscle of genetic diversity mice

2.3 利用The GeneMine篩選EV71致病相關(guān)基因

The GeneMine(http://130.95.9.22/Geniad2/)是一個專門用于遺傳多樣性小鼠復(fù)雜性狀研究的系統(tǒng)遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫，可以分析表型與基因型之間的關(guān)系。將上述感染小鼠3 d血液中的病毒載量數(shù)據(jù)輸入The GeneMine中，系統(tǒng)自動計算分析輸入的數(shù)據(jù)，并給出分析結(jié)果。圖3A為EV71致病相關(guān)基因在小鼠20對染色體上的分布峰圖，如圖所示，發(fā)現(xiàn)在3號、5號、10號、11號、15號、16號、19號染色體均有顯著峰值，其中LOD值為P值得對數(shù)值，LOD值越大，統(tǒng)計學(xué)差異越大，由圖可知11號染色體附近峰值最為突出，推測與EV71感染引起手足口病的主效應(yīng)基因主要集中在11號染色體上。圖3B是11號染色體峰值附近放大后的圖示，可以發(fā)現(xiàn)該峰值較寬，包含了約6 Mbp的核苷酸序列，與EV71致病相關(guān)的基因就分布在該段核苷酸序列內(nèi)。圖3C顯示的是該核苷酸序列區(qū)域的基因與8個親本之間的相關(guān)性，正值代表正相關(guān)，負值代表負相關(guān)，數(shù)值越大相關(guān)性越大。從圖中可以發(fā)現(xiàn)主效應(yīng)基因與親本CAST /EiJ相關(guān)性最大，與親本W(wǎng)SB /EiJ相關(guān)性最小。

由此可知，The GeneMine系統(tǒng)遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫可快速高效地分析表型與基因型之間的關(guān)系，在本研究中也即感染EV71小鼠3 d血液病毒載量與EV71易感基因之間的關(guān)系，并獲得與EV71易感相關(guān)的候選基因，為后續(xù)建立基因敲除小鼠，驗證這些候選基因與EV71致病性的關(guān)聯(lián)工作提供基礎(chǔ)。

表2 53個EV71致病相關(guān)候選基因Table 2 53 candidate genes related to EV71 pathogenicity

圖3 The GeneMine MugaQTL遺傳分析圖Figure 3 The GeneMine MugaQTL genetic analysis

2.4 EV71致病相關(guān)基因分析

利用The GeneMine數(shù)據(jù)庫計算分析，獲得了66個EV71致病相關(guān)候選基因。通過進一步篩查發(fā)現(xiàn)有13個是目前沒有研究的基因，刪除這些基因后，最終確定了53個EV71致病相關(guān)候選基因。按照生物學(xué)功能對這53個基因進行分類，可分為免疫相關(guān)類、代謝相關(guān)類、腫瘤相關(guān)類、復(fù)制轉(zhuǎn)錄相關(guān)類和其它類(見表2)。同時，對這五類基因在所有候選基因中所占比例進行做圖(見圖4)。其中免疫相關(guān)類所占比例為28.30%，癌癥相關(guān)類和復(fù)制轉(zhuǎn)錄相關(guān)類占比相等，均為16.98%，代謝相關(guān)類占比為15.09%，其它類占比為22.64%。從圖4我們發(fā)現(xiàn)這五類基因所占比例相差不大，其中免疫相關(guān)類占比最高，提示在EV71易感性方面，宿主免疫反應(yīng)是很重要的影響因素之一，應(yīng)該著重關(guān)注。

圖4 各類EV71致病相關(guān)候選基因占比Figure 4 Proportion of candidate genes related to EV71

3 討論

遺傳多樣性小鼠資源提供了一個獨特的平臺，在復(fù)雜性狀的研究領(lǐng)域具有很大優(yōu)勢。遺傳多樣性小鼠資源不僅可以用于復(fù)雜數(shù)量性狀位點的確認，得到的遺傳多樣性小鼠自身的特點有很大的差異，表現(xiàn)為不同疾病的易感性差異。例如Rogala等[11]發(fā)現(xiàn)，遺傳多樣性小鼠中的CC011/Unc品系，表現(xiàn)為自發(fā)結(jié)腸炎，是新型的自發(fā)結(jié)腸炎動物模型。此外，具有遺傳多樣性小鼠在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中能夠體現(xiàn)臨床表現(xiàn)的個體差異性，比如通過遺傳多樣性小鼠建立埃博拉疾病模型，研究者在遺傳多樣性小鼠中成功篩選到易感品系和抵抗品系，并且易感品系出現(xiàn)明顯的體重下降以及出血熱癥狀包括長期凝血、內(nèi)出血、咖啡色血液、脾腫大、肝變色和質(zhì)地軟化等，最終死于致命感染[12]。因此，遺傳多樣性小鼠的繁育和發(fā)展可以為人類多種疾病的研究提供適用的動物模型。

本研究利用遺傳多樣性小鼠資源豐富的遺傳多樣性、清晰的遺傳背景和簡單的實驗設(shè)計步驟等優(yōu)勢，快速高效地篩選到EV71引起的手足口病致病相關(guān)的數(shù)量性狀基因，利用The GeneMine數(shù)據(jù)庫計算分析獲得了53個EV71致病相關(guān)候選基因，按照生物學(xué)功能對這53個基因進行分類，分為免疫相關(guān)類、代謝相關(guān)類、腫瘤相關(guān)類、復(fù)制轉(zhuǎn)錄相關(guān)類和其它類。免疫相關(guān)類基因在EV71感染致病的過程中起重要作用，是未來建立基因敲除小鼠，做進一步驗證實驗重點關(guān)注的對象。特別是免疫相關(guān)類的干擾素調(diào)節(jié)蛋白基因Slfn，其表達產(chǎn)物是干擾素調(diào)節(jié)蛋白(SLFN)，SLFN在調(diào)節(jié)T細胞的發(fā)育和活化中起重要作用[13]。Slfn家族成員包括Slfn5，Slfn1，Slfn8，Slfn9，Slfn14，Slfn3，Slfn4，Slfn14等，其中Slfn8基因和Slfn9基因參與調(diào)節(jié)T細胞在胸腺中的生長、發(fā)育、成熟和分化[14]，在宿主遭遇外界抗原刺激并經(jīng)抗原提呈細胞表面特異性抗原肽及其他信號的共同刺激時，成為效應(yīng)和記憶性T細胞，參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答和免疫記憶的維持。此外，Ccl基因表達的CCL又稱為巨噬細胞炎癥蛋白(MIP)，其家族成員有CCL3，CCL4，CCL9 / 10和CCL15，主要由巨噬細胞、樹突狀細胞和淋巴細胞產(chǎn)生。MIP-1蛋白可通過與G蛋白偶聯(lián)的細胞表面受體(CCR1,3,5)起作用，起趨化和促炎的作用，但也可促進同源性穩(wěn)態(tài)。其中的Ccl9基可誘導(dǎo)CD4+T細胞克隆和脾臟中CD4+T細胞的趨化性和Ca2+離子流[15]。發(fā)現(xiàn)的53個EV71致病相關(guān)基因中，其中有15個是與免疫相關(guān)的基因，占比28.30%，在幾類基因中所占比例最高，由此推測，免疫反應(yīng)類相關(guān)基因在手足口病致病過程中具有重要意義。因此，研究人員下一步的工作將挑選免疫相關(guān)類候選基因做基因敲除小鼠，驗證該基因在EV71感染致病性中的確切作用。

此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)了手足口病易感小鼠，遺傳多樣性小鼠在感染EV71病毒后表現(xiàn)出明顯的差異性，其中有7個品系分別是FEW、DAVIS、BOM、LAM、POH、LIV、PWK對EV71病毒具有易感性，突出表現(xiàn)在感染3 d后血液病毒載量高，后肢骨骼肌出現(xiàn)明顯病理損傷等，與陰性對照組具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。易感小鼠的發(fā)現(xiàn)將有助于建立非基因修飾的易感小鼠模型。

綜上所述，本研究篩選到了EV71引起的手足口病致病相關(guān)的數(shù)量性狀基因，也發(fā)現(xiàn)了易感小鼠品系。一方面擴展了手足口疾病動物模型，另一方面也有助于更深的了解病毒與宿主相互作用的關(guān)系，有助于發(fā)現(xiàn)手足口病疾病的發(fā)病機制及疾病轉(zhuǎn)歸。但是，相關(guān)實驗仍需進一步補充完善，候選致病基因的驗證工作是必要的，下一步我們將建立基因敲除小鼠，驗證候選致病基因的功能。