本文討論了橙汁中康唑類殺菌劑（包括多菌靈）的樣品制備策略。首先，使用QuEChERS方法的DisQuE產(chǎn)品進(jìn)行樣品制備，用以檢測(cè)各種水果、蔬菜和果汁中的殺蟲劑含量。結(jié)合QuEChERS方法，UPLC/MS/MS可以輕易檢測(cè)出10μg/L（ppb）包括多菌靈在內(nèi)的5種康唑類殺菌劑，且無(wú)需進(jìn)行進(jìn)一步的樣品制備操作。QuEChERS提取液可以作為前體樣品，然后進(jìn)一步凈化并使用液相色譜UV檢測(cè)器分析其中ppb水平的多菌靈和其他康唑類殺菌劑目標(biāo)分析物。利用Oasis MCX小柱進(jìn)行固相萃?。⊿PE）可對(duì)待測(cè)物進(jìn)行富集，并減少基質(zhì)干擾。該方法通過(guò)使用配備UV檢測(cè)的液相色譜可完成多菌靈樣品在低ppb水平的準(zhǔn)確定量。Oasis MCX凈化操作雖然不是UPLC/MS/MS分析的必需步驟，卻能夠減少基質(zhì)效應(yīng)而得到更加潔凈的提取物。因此，使用QuEChERS方法DisQuE產(chǎn)品制備的樣品適用于UPLC/MS/MS直接分析，及經(jīng)混合模式SPE富集和凈化之后的HPLC/UV測(cè)定。

沃特世解決方案

Xevo？ TQ質(zhì)譜；ACQUITY UPLC？ H-Class系統(tǒng)；ACQUITY UPLC BEH C18柱；XBridgeTM BEH C18XP色譜柱；DisQuETM試劑袋產(chǎn)品；Oasis？ MCX萃取柱；LCMS認(rèn)證樣品瓶。

實(shí)驗(yàn)

用作質(zhì)譜分析的UPLC條件

系統(tǒng)：ACQUITY UPLC H-Class；

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×100mm，1.7μm（部件編號(hào)：186002352）；

進(jìn)樣量：10μL；

溫度：40℃；

流動(dòng)相A：0.1%NH4OH水溶液；

流動(dòng)相B：0.1%NH4OH甲醇溶液；

流速：0.40mL/min；

梯度：流動(dòng)相B初值為10%，4分鐘內(nèi)線性梯度增至90%，保持5分鐘，降回至10%B，持續(xù)5.1分鐘。保持并再平衡7分鐘。

用作XP色譜柱UV分析的HPLC條件

系統(tǒng)：ACQUITY UPLC H-Class；檢測(cè)：PDA檢測(cè)器；

色譜柱：X B r i d g e C1 8X P，4.6×100mm，2.5μm（部件編號(hào)：186006039）；

進(jìn)樣量：50μL；

溫度：40℃；

流動(dòng)相A：20mm磷酸鉀水溶液（pH6.8）；

流動(dòng)相B：乙腈；

流速：1.3mL/min；

梯度：25%B的初值保持3.4分鐘，9.7分鐘內(nèi)線性梯度增至65%B，保持11.0分鐘，然后線性梯度增加至95%，保持13.0分鐘，之后降回至25%B，持續(xù)13.2分鐘。保持并再平衡18.3分鐘。

樣品制備

使用QuEChERS方法進(jìn)行初步提?。簩?5mL橙汁樣品加到50mL的離心管內(nèi)。加入15mL1%乙酸乙腈（ACN）溶液，振搖1分鐘。加入為AOAC QuEChERS方法準(zhǔn)備的DisQuE試劑（部件編號(hào)186006812），劇烈搖勻1分鐘。然后在3000rpm下離心5分鐘。對(duì)不使用固相萃取，直接進(jìn)行UPLC/ MS/MS分析的樣品，將0.5mL上清液加水稀釋至1.0mL。

SPE凈化：使用Oasis MCX小柱的固相萃取方法可對(duì)堿性化合物（例如康唑類殺菌劑）進(jìn)行凈化。準(zhǔn)備進(jìn)行LC/UV分析前（如果需要凈化樣品），從QuEChERS提取物中取2mL上清液，加入6mL0.01M HCl水溶液，然后混均。使用一根3cc Oasis MCX柱進(jìn)行固相萃取凈化操作。QuEChERS提取液以酸性水溶液稀釋，從而提高混合模式SPE保留，同時(shí)水溶液稀釋增加了反相保留。

質(zhì)譜條件

質(zhì)譜儀：Waters？ Xevo TQ。

結(jié)果與討論

使用QuEChERS方法能夠在UPLC/ MS/MS分析之前有效地萃取康唑類殺菌劑。其中的一種殺菌劑——多菌靈，未經(jīng)注冊(cè)卻被確證出現(xiàn)在市售的橙汁樣品中。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)質(zhì)譜分析實(shí)現(xiàn)了該化合物在1ppb的水平上的確證，同時(shí)LC/ UV檢測(cè)限也達(dá)到了10ppb水平。研究結(jié)果顯示，使用了QuEChERS樣品制備方法的DisQuE產(chǎn)品，不僅能夠?qū)颠蝾悮⒕鷦┻M(jìn)行有效的UPLC/MS/MS分析，而且通過(guò)適當(dāng)?shù)膬艋僮鞑襟E，還能使用LC/UV檢測(cè)出較低ppb水平的殺菌劑。

以上測(cè)定結(jié)果也驗(yàn)證了一個(gè)重要的結(jié)論：對(duì)于大部分基質(zhì)中存在的多種殺菌劑及相關(guān)化合物，QuEChERS方法是一種非常有效的樣品制備技術(shù)。隨后的樣品凈化程度完全取決于分析人員的需求、檢測(cè)方法的靈敏度和特異性。分析過(guò)程表明，雖然SPE凈化步驟只是推薦性而非高效率的UPLC/MS/MS分析所必需的過(guò)程，但是另一方面，要實(shí)現(xiàn)低ppb水平的多菌靈LC/UV測(cè)定，則必須進(jìn)行包括隨后Oasis MCX的固相萃取過(guò)程。

不使用SPE凈化的UPLC/MS/MS分析

通過(guò)對(duì)每種殺菌劑的10ppb加標(biāo)（多菌靈為1ppb）橙汁樣品的UPLC/MS/MS重現(xiàn)圖譜的分析，使用外標(biāo)計(jì)算方法得到的五點(diǎn)基質(zhì)匹配曲線（未示出）中，所有康唑類殺菌劑的相關(guān)系數(shù)（r2）都大于0.995。根據(jù)橙汁基質(zhì)中制備的3份平行樣品得到的結(jié)果測(cè)定康唑殺菌劑的回收率，其范圍為92%～110%且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（%）小于7%?；厥章蕦?shí)驗(yàn)的具體操作方法：分別在QuEChERS萃取之前和萃取后的果汁樣品中進(jìn)行殺菌劑加標(biāo)，并將兩者所得的MRM峰面積進(jìn)行對(duì)比?；|(zhì)效應(yīng)（抑制比%）由QuEChERS萃取后的殺菌劑加標(biāo)上清液的MRM峰面積與用50∶50乙腈/水制備的等量殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)品峰面積進(jìn)行對(duì)比得出。

使用SPE凈化的LC/UV分析

使用SPE凈化的LC/UV回收率與100ppb水平加標(biāo)樣品的UPLC/MS/MS分析結(jié)果相似。圖1是使用XP色譜柱的LC/UV方法測(cè)定抑霉唑、腈苯唑和苯醚甲環(huán)唑所得的色譜圖。多菌靈和噻菌靈在可見的280nm至300nm處缺少有效發(fā)色團(tuán)；然而在220nm處卻能達(dá)到很高的靈敏度，這在很大程度上是因?yàn)槭褂昧俗贤饪纱┩傅牧鲃?dòng)相（磷酸鉀）。

已測(cè)樣品的分析

圖2是對(duì)已測(cè)橙汁樣品分析得到的LC/UV色譜圖?？煽闯鍪褂肙asis MCX小柱可獲得高水平樣品凈化效果。上方為未使用SPE凈化的色譜圖，下方為使用Oasis MCX凈化后的色譜圖。圖3是同時(shí)使用QuEChERS方法和Oasis MCX小柱凈化后得到的色譜圖，以及對(duì)相同的樣品只使用QuEChERS方法而未使用Oasis MCX小柱凈化的UPLC/MS/MS圖譜。結(jié)果吻合度良好，LC/UV檢測(cè)到11ppb的多菌靈，UPLC/MS/MS檢測(cè)到13ppb的多菌靈。在受檢的橙汁樣品中未鑒別出其他殺菌劑。圖4是已測(cè)樣品的UV圖譜與ppb標(biāo)準(zhǔn)品得到的參比圖譜的對(duì)比，證實(shí)了橙汁樣品中殘留物的存在。

結(jié)論

DisQuE試劑袋（QuEChERS）能夠有效地從橙汁中萃取康唑類殺菌劑；該方法可提供高通量和低檢測(cè)限的分析，分析過(guò)程快速、簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、安全；QuEChERS提取液可直接用于UPLC/MS/ MS分析，而不用進(jìn)一步凈化；簡(jiǎn)潔的Oasis MCX固相萃取流程為低ppb檢測(cè)限的多菌靈UV檢測(cè)提供了有效的樣品凈化和富集方法；Oasis MCX固相萃取凈化能夠增強(qiáng)UPLC/MS/MS的分析性能，即使這一步驟并非必需過(guò)程；經(jīng)固相萃取凈化后的橙汁樣品中的多菌靈，其LC/UV與UPLC/MS/MS分析結(jié)果達(dá)到一致。endprint