桑燕嬌 寧喜斌

摘要 水產(chǎn)品中副溶血性弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌均是食源性致病菌，對(duì)這些菌種靈敏、快速的檢測(cè)方法對(duì)水產(chǎn)品安全以及保護(hù)人類健康極為重要。主要綜述了水產(chǎn)品中副溶血性弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌的分子生物學(xué)檢測(cè)研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞 副溶血性弧菌;溶藻弧菌;創(chuàng)傷弧菌;PCR技術(shù)

中圖分類號(hào) S986.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）33-11871-04

Research Progress of PCR Technology Detection of Vibrio in Aquatic Products

SANG Yan-jiao， NING Xi-bin*

（Shanghai Ocean University， Shanghai 201306）

Abstract Vibrio parahaemolyticus， Vibrio alginolyticus， Vibrio vulnificus in aquatic products are foodborne pathogens. Sensitive， rapid detection methods for seafood safety and the protection of human health is extremely important. This paper summarizes that research progress of molecular biology detection of Vibrio parahaemolyticus， Vibrio alginolyticus， Vibrio vulnificus in aquatic products.

Key words Vibrio parahaemolyticus; Vibrio alginolyticus; Vibrio vulnificus; PCR technology

基金項(xiàng)目 上海市科委工程中心建設(shè)項(xiàng)目（11DZ2280300）;上海市精品課程資助項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介 桑燕嬌（1990-），女，江蘇南通人，碩士研究生，研究方向：食品安全。*通訊作者，教授，博士，從事食品安全、微生物學(xué)研究。

收稿日期 2014-10-15

水產(chǎn)品由于其具有豐富的營(yíng)養(yǎng)、鮮美的味道、脂肪含量低、蛋白質(zhì)含量高等特點(diǎn)，已成為風(fēng)靡全球的健康食品，且食用的地區(qū)及人群在不斷擴(kuò)大[1]，因此它的安全性得到了很大的關(guān)注。水產(chǎn)品易受到不同程度的污染，其中受到弧菌污染比較嚴(yán)重，所以對(duì)水產(chǎn)品中微生物的分析和監(jiān)控，能使水產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性得到提高[2]。

目前檢測(cè)弧菌的方法有傳統(tǒng)的生理生化測(cè)定;分子生物學(xué)技術(shù)，如LAMP、PCR檢測(cè)技術(shù)，核酸探針技術(shù)，16sRNA檢測(cè)技術(shù)等;免疫學(xué)方法，如ELISA技術(shù)、Western blot、免疫熒光技術(shù)等[3];傳感器技術(shù)，如電化學(xué)技術(shù)、電子鼻技術(shù)等。筆者主要綜述PCR技術(shù)檢測(cè)水產(chǎn)品中副溶血性弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌的研究進(jìn)展。

1 水產(chǎn)品中弧菌概述

弧菌是一類重要的食源性致病菌，廣泛分布于水產(chǎn)品中，是水生動(dòng)物弧菌病的病原體，主要引起人體腸道疾病、傷口感染和敗血癥等病癥[3]。

1.1 副溶血性弧菌

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是革蘭氏陰性嗜鹽菌，隸屬弧菌科中的弧菌屬，它是一種人畜共患病菌[4]。其主要致病性在于它可以產(chǎn)生3種溶血性毒素，分別為不耐熱溶血毒素（thermolabile hemolysin，TLH）、耐熱直接溶血毒素（thermostable direct hemolysin，TDH）和耐熱相關(guān)直接溶血毒素（thermostable related hemolysin，TRH），分別由tlh、tdh、trh基因編碼。

人若食用了受該菌污染的水產(chǎn)品后，會(huì)引發(fā)食物中毒，主要癥狀為腹瀉、腸痙攣、惡心等典型腸胃炎反應(yīng)，嚴(yán)重者可引起敗血癥[5]。根據(jù)國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示[6]，副溶血性弧菌引起的食物中毒，在發(fā)生規(guī)模及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢(shì)，已經(jīng)高居微生物性食物中毒首位。

1.2 溶藻弧菌

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）又名解藻阮酸弧菌、解藻酸弧菌或解藻阮酸貝內(nèi)克氏菌，是革蘭氏陰性短桿菌，隸屬弧菌科中的弧菌屬，為嗜鹽嗜溫性、兼性厭氧菌[7]，是一種人和海洋動(dòng)物共感染的病原菌[8-9]。溶藻弧菌廣泛分布于海洋及江河入海口水域，并且數(shù)量居海水類弧菌之首[10]，但由于其是嗜溫菌，因此從夏季到冬季，由赤道向兩極隨著溫度的降低其數(shù)量也明顯減少[11-12]。此外，在海洋動(dòng)物中也存在著大量的溶藻弧菌[13]。

溶藻弧菌的致病性主要取決于弧菌與宿主細(xì)胞之間的相互作用，其致病過(guò)程包括粘附、侵襲、體內(nèi)增殖及產(chǎn)生毒素等[14]。溶藻弧菌的致病作用主要與它產(chǎn)生的各種毒力因子有關(guān)，其毒力因子主要有粘附素、胞外產(chǎn)物（如堿性絲氨酸蛋白酶和膠原蛋白酶等）、外膜蛋白及攝鐵系統(tǒng)等[15-16]。

1.3 創(chuàng)傷弧菌

創(chuàng)傷弧菌（vibrio vulnificus）是一種帶有莢膜的革蘭氏陰性嗜鹽菌，屬于弧菌屬第五群，與霍亂弧菌、腸炎弧菌同屬致病性弧菌，廣泛分布于蝦類、魚類及貝母類等水生動(dòng)物體內(nèi)[17]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，人一旦感染了創(chuàng)傷弧菌，短時(shí)間內(nèi)會(huì)引起傷口炎癥，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致敗血癥，而且發(fā)病迅速，死亡率較高[18]，尤其是對(duì)于已經(jīng)患有肝壞死、慢性腎功能衰竭和免疫功能低下以及有糖尿病病史的患者[19]。

根據(jù)創(chuàng)傷弧菌的生化、遺傳、血清學(xué)試驗(yàn)的差異和受感染宿主的不同，將其分為3種生物型[20-21]。生物型I產(chǎn)吲哚，人類感染通常表現(xiàn)為散發(fā)形式，且?guī)缀醵际怯捎谏镄虸所致;生物型II不產(chǎn)吲哚，是魚類的重要病原菌，特別是對(duì)鰻魚的感染性很強(qiáng)，但后來(lái)Amaro等試驗(yàn)證實(shí)，它也是人類疾病的條件致病菌[22];生物型III于1996 年首次報(bào)道可引起人類敗血癥和軟組織感染[23]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌的致病因子主要有細(xì)胞外蛋白酶、彈性蛋白酶、金屬蛋白酶、溶細(xì)胞毒素等。

2 PCR技術(shù)的研究進(jìn)展

PCR是1985年由美國(guó)Kary Mullis等首創(chuàng)并由美國(guó)Cetus公司開(kāi)發(fā)的一項(xiàng)體外擴(kuò)增DNA的方法，應(yīng)用該方法可使極微量的特定DNA片斷在幾小時(shí)內(nèi)迅速擴(kuò)增至百萬(wàn)倍[24]。PCR技術(shù)具有靈敏度高、快速準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[24]。隨著人們對(duì)于食品安全問(wèn)題越來(lái)越重視，PCR技術(shù)在食品中的應(yīng)用得到了廣泛的推廣，主要用于微生物中致病菌、益生菌的檢測(cè)，并制定出解決方案。PCR技術(shù)主要分為常規(guī)PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR。下面主要對(duì)這3種PCR技術(shù)檢測(cè)副溶血性弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行了綜述。

2.1 常規(guī)PCR技術(shù)

常規(guī)PCR技術(shù)主要應(yīng)用于環(huán)境、食品、臨床等不同來(lái)源樣品的快速檢測(cè)。

2.1.1

常規(guī)PCR技術(shù)檢測(cè)副溶血性弧菌。李志峰等檢測(cè)副溶血性弧菌的標(biāo)準(zhǔn)株和分離株，其靈敏度可達(dá)2.4×102 CFU/ml，并將擴(kuò)增的tlh基因測(cè)序結(jié)果與GenBank中已收錄的tlh基因序列比較，兩序列的同源性達(dá)99%;結(jié)果表明該檢測(cè)方法快捷、特異性好、敏感性高[25]。王華麗等利用toxR基因檢測(cè)副溶血性弧菌并對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行多次優(yōu)化[26];結(jié)果表明該檢測(cè)方法的靈敏度及檢測(cè)時(shí)間等指標(biāo)均優(yōu)于鐘凱等[27]的報(bào)道。黃晨陽(yáng)等基于toxR基因的環(huán)引物PCR法和已報(bào)道的PCR法對(duì)副溶血性弧菌和食品樣品進(jìn)行檢測(cè)，并優(yōu)化反應(yīng)條件[28];結(jié)果表明2種方法檢測(cè)副溶血性弧菌的特異度均為100%，檢出限分別為4×103 CFU/ml和5×104 CFU/ml。因此基于toxR基因的環(huán)引物PCR法檢測(cè)副溶血性弧菌的特異性更強(qiáng)，檢出限更低，檢測(cè)所需時(shí)間更短，能夠較好地滿足衛(wèi)生防疫機(jī)構(gòu)快速檢測(cè)副溶血性弧菌的需要。何曉華等將人工構(gòu)建擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)引入PCR檢測(cè)體系，從而檢測(cè)副溶血性弧菌[29];經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該P(yáng)CR反應(yīng)體系的檢測(cè)靈敏度為1.16×102 CFU/ml。結(jié)果表明，該試驗(yàn)方法能特異地檢測(cè)副溶血性弧菌，并可有效地排除假陰性，提高檢測(cè)準(zhǔn)確率。

2.1.2

常規(guī)PCR技術(shù)檢測(cè)溶藻弧菌。韓一凡等根據(jù)溶藻弧菌toxR基因的高變區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行特異性和敏感性試驗(yàn)[30]。結(jié)果表明，該方法能特異地檢測(cè)出溶藻弧菌，每個(gè)PCR反應(yīng)檢測(cè)的敏感度為0.01 pg的DNA 和3.7×103 CFU/ml的細(xì)菌，可用于對(duì)感染溶藻弧菌的水生動(dòng)物疾病進(jìn)行診斷。龐興紅等根據(jù)溶藻弧菌毒力菌株HN08155的1個(gè)新的特異性基因序列設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物SDRHf和SDRHr ， 從而建立了與HN08155具有相似遺傳型的溶藻弧菌毒力菌株P(guān)CR快速分子檢測(cè)試劑盒[31]。結(jié)果表明，該方法具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為海產(chǎn)品及水體中溶藻弧菌的檢測(cè)提供了一種有效方法。

2.1.3

常規(guī)PCR技術(shù)檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌。

Kumar等建立了檢測(cè)海產(chǎn)品創(chuàng)傷弧菌gyrB基因的PCR程序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的創(chuàng)傷弧菌都出現(xiàn)一條285 bp的特異性條帶，其他細(xì)菌沒(méi)有特異擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)該法的特異性強(qiáng)[32]。石琰璟等采用vvhA基因檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌，靈敏度為3.6×102 CFU/ml比PCR-瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法高一個(gè)數(shù)量級(jí)[33]。結(jié)果表明，該方法具有較高靈敏度和良好特異性，操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快。鄧曦等利用Design-Expert軟件中的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)一組3因素3水平試驗(yàn)，通過(guò)響應(yīng)曲面分析，得到優(yōu)化培養(yǎng)參數(shù)為：含鹽量3.65%，pH 6.75，培養(yǎng)溫度37 ℃，在該條件下培養(yǎng)液的OD595nm為0.520;然后用PCR對(duì)樣品進(jìn)行快速檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該菌的檢出率高達(dá)23.3%;結(jié)果表明，該法能快速有效檢測(cè)水產(chǎn)品中存在的創(chuàng)傷弧菌[34]。

2.2 多重PCR技術(shù)

多重PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，指在同一PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入多對(duì)擴(kuò)增不同基因的引物，達(dá)到一次反應(yīng)可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)基因的目的，這樣提高了檢測(cè)的通量，大大縮短了檢測(cè)的時(shí)間。

吳彩云等建立了一種雙重 PCR方法，運(yùn)用該方法可同時(shí)檢測(cè)攜帶有tlh和tdh基因的副溶血性弧菌毒力菌株[35]。結(jié)果表明，該法不但具有常規(guī)PCR的優(yōu)點(diǎn)，而且還能節(jié)省耗材和時(shí)間，可用于檢測(cè)水產(chǎn)食品以及臨床樣品中的副溶血性弧菌的毒力菌株。Bej等根據(jù)副溶血性弧菌的tlh、tdh和trh基因設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用多重PCR檢測(cè)111份樣品中的副溶血性弧菌[36]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法敏感性高、特異性強(qiáng)，而且能區(qū)分產(chǎn)毒株和非產(chǎn)毒株，遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)方法。

張新中等針對(duì)創(chuàng)傷弧菌和副溶血性弧菌的gyrB基因的不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，從而對(duì)3種海產(chǎn)品進(jìn)行了創(chuàng)傷弧菌和副溶血性弧菌的檢測(cè)，結(jié)果在部分海產(chǎn)品中能特異性地檢測(cè)到目標(biāo)菌株[37]。該方法快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)，為海產(chǎn)品的創(chuàng)傷弧菌和副溶血性弧菌的檢測(cè)提供了有效的方法。劉陽(yáng)等根據(jù)副溶血性弧菌和溶藻弧菌的toxR基因序列設(shè)計(jì)針對(duì)這2種細(xì)菌的2對(duì)特異性引物，建立能夠快速同時(shí)檢測(cè)這2種細(xì)菌的雙重PCR方法，并對(duì)該反應(yīng)體系的特異性和靈敏度進(jìn)行檢測(cè)[38]。結(jié)果顯示，純培養(yǎng)細(xì)菌VP和VA的檢測(cè)靈敏度分別為2.32×103 CFU/ml和2.56×103 CFU/ml，臨床病料檢測(cè)靈敏度分別為2 CFU和3 CFU;與其他菌無(wú)交叉反應(yīng);研究表明，該方法操作簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好，并且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，值得推廣應(yīng)用。魏霜等以細(xì)菌16S rRNA 基因?yàn)閿U(kuò)增內(nèi)標(biāo)靶序列，針對(duì)溶藻弧菌gyrB基因、副溶血性弧菌collagenase基因、創(chuàng)傷弧菌vvhA基因、霍亂弧菌ompW基因，分別設(shè)計(jì)特異性引物，建立多重 PCR 體系，對(duì)其靈敏度和特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并將建立的五重 PCR 應(yīng)用于弧菌的篩選[39]。結(jié)果顯示，該方法能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)溶藻弧菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌和霍亂弧菌4種食源性致病菌，靈敏度高，并能有效指示PCR反應(yīng)的假陰性，適用于食品中常見(jiàn)致病性弧菌的快速篩檢。

2.3 熒光定量PCR技術(shù)

熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA（ 或cDNA）的起始濃度進(jìn)行定量，從而計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板的方法[40]。

2.3.1

熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)副溶血性弧菌。

George等利用熒光定量PCR檢測(cè)牡蠣中副溶血性弧菌tdh陽(yáng)性株，與傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)方法比較，結(jié)果顯示該方法更快速、準(zhǔn)確、靈敏度更高[41]。孫宏迪等根據(jù)副溶血性弧菌tdh基因設(shè)計(jì)合成引物及TaqMan探針，利用陽(yáng)性質(zhì)粒和模擬標(biāo)本建立副溶血性弧菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法[42]。結(jié)果表明，該方法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)102 CFU/μl，并且特異性強(qiáng)，重復(fù)性好。LO等運(yùn)用雙重PCR雜交探針建立的以toxR和tdh2為目標(biāo)基因的熒光定量檢測(cè)體系[43]與Tyagi等建立的以SYBR為熒光染料的熒光定量PCR方法[44]相比，檢測(cè)效果更敏感快速。許龍巖等根據(jù)副溶血性弧菌的toxR基因和tdh基因，建立基于TaqMan探針雙重?zé)晒釶CR體系，進(jìn)行副溶血性弧菌的特異性、敏感性試驗(yàn)，其最低檢測(cè)濃度達(dá)到3.6×102 CFU/ml[45]。結(jié)果表明，該方法特異性好、靈敏度高，可用于食品中副溶血性弧菌的特異性及毒力基因檢測(cè)。

2.3.2

熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)溶藻弧菌。

目前利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)溶藻弧菌只有王海波等研究了，他們根據(jù)溶藻弧菌膠原酶基因colH的保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物和1條TaqMan探針，優(yōu)化反應(yīng)體系中的引物濃度和探針濃度，評(píng)價(jià)此反應(yīng)體系的特異度[46]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化的反應(yīng)體系中較普通PCR提高了100倍，特異度為100%。結(jié)果表明，該法能夠靈敏和特異地檢測(cè)溶藻弧菌，可以作為溶藻弧菌的快速檢測(cè)方法。

2.3.3

熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌。

Panicker等采用TaqMan實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)vvhA基因的3對(duì)寡核苷酸引物和2個(gè)探針[47]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，81株創(chuàng)傷弧菌都出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果，而25株非弧菌細(xì)菌和12株非目標(biāo)弧菌的擴(kuò)增結(jié)果都為陰性。結(jié)果表明，該方法具有快速、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。吳增輝等根據(jù)位于vvhA基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.01 ng[48]。結(jié)果表明，該方法具有快速、穩(wěn)定、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)，適合用于臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行創(chuàng)傷弧菌引起的敗血癥和創(chuàng)口感染快速診斷。潘軍航等根據(jù)vvhA基因序列設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性強(qiáng)，僅對(duì)創(chuàng)傷弧菌呈陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)預(yù)增菌5 h后經(jīng)QIAamp DNA miniKit提取的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，其檢測(cè)效果最佳，靈敏度達(dá)1.4 CFU/ml[49]。結(jié)果表明，該方法具有快速、特異性強(qiáng)、敏感高等特點(diǎn)，且能在8 h內(nèi)完成在牡蠣等海產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的快速檢測(cè)。

3 總結(jié)與展望

通過(guò)上述研究可以發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR技術(shù)的靈敏度比較高，但是成本比較高，對(duì)于基層單位使用負(fù)擔(dān)比較大，與其他2種技術(shù)相比其省去了凝膠電泳的繁瑣操作，避免了試驗(yàn)過(guò)程中污染，既減少了假陽(yáng)性的發(fā)生率，又縮短了檢測(cè)時(shí)間，近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用于臨床、食品等樣品中致病菌的檢測(cè);而常規(guī)PCR技術(shù)雖然成本低，但是它不能定量，靈敏性相對(duì)較低;多重PCR技術(shù)的體系比較復(fù)雜，需要花費(fèi)更多的時(shí)間去摸索穩(wěn)定的體系，以及要避免引物之間形成二聚體，干擾試驗(yàn)結(jié)果，但它消耗的時(shí)間和試劑比較少，而且還可減少或避免因操作步驟過(guò)多而污染所帶來(lái)的假陽(yáng)性等問(wèn)題。

隨著研究的深入，人們可以加強(qiáng)溶藻弧菌對(duì)哺乳動(dòng)物特別是人類的致病機(jī)理的研究，對(duì)創(chuàng)傷弧菌的研究也需進(jìn)一步的推進(jìn)，對(duì)弧菌假陰性的研究以及各種弧菌間是否有交叉污染也要進(jìn)一步的深入研究。相信隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，新的技術(shù)、儀器不斷的出現(xiàn)，PCR會(huì)不斷完善，特別是與各種分子技術(shù)的融合和創(chuàng)新，這將會(huì)促使水產(chǎn)品中的弧菌快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異、大規(guī)模檢測(cè)的實(shí)現(xiàn)。

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