丁實(shí) 周健 畢紅東

【摘 要】目的：本研究的目的是探討PCR技術(shù)聯(lián)合常規(guī)方法在肺外結(jié)核疾病中的診斷效果。材料和方法：所有標(biāo)本均采集于在臨床上疑似肺外結(jié)核的病例。我們利用齊尼氏痰涂片檢查（ZNS），改良羅氏培養(yǎng)法（LJM）和PCR技術(shù)對(duì)勻漿標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：總共有182例疑似為肺外結(jié)核的標(biāo)本節(jié)接受了上述三種方法的檢查。其中22例經(jīng)至少一種方法檢測(cè)證實(shí)為陽(yáng)性。PCR技術(shù)檢測(cè)出肺外結(jié)核病例最多，其次是細(xì)菌培養(yǎng)。結(jié)論：聯(lián)合使用現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)可以提高實(shí)驗(yàn)室對(duì)存在于臨床標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌的檢出率。而PCR技術(shù)必須包含在肺外結(jié)核的診斷程序之中。

【關(guān)鍵詞】肺外結(jié)核；PCR 金標(biāo)準(zhǔn)

【文章編號(hào)】1004-7484（2014）06-3508-02

結(jié)核病是一項(xiàng)重大的公共健康問(wèn)題。每年，世界范圍內(nèi)新增確診病例超過(guò)900萬(wàn)，而登記在冊(cè)的死亡病例將近200萬(wàn)[1]。肺外結(jié)核占所有免疫功能不全并罹患結(jié)核的病人總數(shù)的1/5。在HIV陽(yáng)性個(gè)體中，肺外結(jié)核發(fā)病率非常高，占全部結(jié)核病例的50%[2]。由于此病對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的抗結(jié)核菌療法比較敏感，所以早期精確的診斷至關(guān)重要。分子生物學(xué)方法是診斷肺外結(jié)核較好的一個(gè)選擇，PCR技術(shù)具有較高的敏感性，特異性和診斷速度[3]。

1 材料和方法：

收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2008年至2013年對(duì)193例疑似肺外結(jié)核的臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果。193例標(biāo)本均進(jìn)行PCR檢測(cè)，其中11標(biāo)本由于量比較小，而未進(jìn)行常規(guī)方法檢測(cè)。對(duì)剩余182例標(biāo)本進(jìn)行PCR檢測(cè)和常規(guī)方法檢測(cè)的對(duì)照分析。

首先將這些收集的標(biāo)本進(jìn)行勻漿化處理。然后對(duì)勻漿化的標(biāo)本進(jìn)行齊尼氏痰涂片，改良羅氏法培養(yǎng)和PCR技術(shù)檢測(cè)。使用QIAampDNA微型試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行提取。

我們利用兩種PCR體外診斷試劑盒【Real-TM（Sacace）J檢測(cè)試劑盒以IS6110為靶序列設(shè)計(jì)引物，Seeplex多重分子檢測(cè)診斷試劑盒（Seegene）以IS6110和MPB64為靶序列設(shè)計(jì)引物】對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。所有接受PCR檢測(cè)的標(biāo)本均進(jìn)行齊尼氏痰涂片檢查以及改良羅氏法的細(xì)菌培養(yǎng)。我們對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行了為8周的觀察。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：我們利用Kappa檢驗(yàn)確定本研究中不同的檢測(cè)方法的結(jié)果是否一致。利用卡方檢驗(yàn)對(duì)于數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SPSS20。

2 結(jié)果：在所有被檢測(cè)的標(biāo)本中肺外結(jié)核總陽(yáng)性率為12.1%（表一）。其中PCR檢測(cè)陽(yáng)性為20例。結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性為9例，痰涂片法為6例。其中，經(jīng)三種方法檢測(cè)，僅PCR技術(shù)顯示為陽(yáng)性的標(biāo)本為10例。而PCR檢測(cè)為陰性，而常規(guī)方法檢測(cè)為陽(yáng)性的標(biāo)本為2例。僅3例標(biāo)本，三種檢測(cè)方法結(jié)果均顯示為陽(yáng)性。PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率在膿液標(biāo)本中最高（表二）。

由于細(xì)菌培養(yǎng)在診斷結(jié)核并不是一項(xiàng)理想的金標(biāo)準(zhǔn)，我們應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)菌培養(yǎng)和PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果的一致性水平。結(jié)果顯示，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果具有中等水平的一致性，Kappa值為0.59。

和痰涂片這種常規(guī)快速的檢測(cè)方法相比，由PCR技術(shù)檢測(cè)出來(lái)肺外結(jié)核陽(yáng)性例數(shù)明顯增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同樣，PCR檢測(cè)出來(lái)的陽(yáng)性病例也明顯多于細(xì)菌培養(yǎng)的結(jié)果。PCR技術(shù)和兩種方法聯(lián)合檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)照也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論：

在本研究中，182例疑似為肺外結(jié)核的病例標(biāo)本，經(jīng)不同的方法檢測(cè)最終有22例得到確診。本研究中， 細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)出的陽(yáng)性率為3.3%。雖然細(xì)菌培養(yǎng)是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其缺乏敏感性、特異性和速度，尤其是在肺外結(jié)核的檢測(cè)方面。

PCR診斷技術(shù)的特異性非常高，而關(guān)于敏感性的報(bào)道卻并不一樣。我們認(rèn)為，只要運(yùn)用合理，PCR技術(shù)在診斷肺外結(jié)核疾病方面具有非常高的敏感性[8]。本研究中，PCR技術(shù)在全部受檢標(biāo)本中檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌的比例為11%。相關(guān)報(bào)道PCR技術(shù)在非呼吸系統(tǒng)標(biāo)本檢出結(jié)核桿菌的陽(yáng)性率為8.6%-63%[9-11]。在本研究，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷證實(shí)的病例中，由PCR技術(shù)檢出的占90.9%，比例最高。而常規(guī)方法檢測(cè)總共占到全部病例的54.6%。所有LJM檢測(cè)為陽(yáng)性的病例，也由PCR技術(shù)證實(shí)為陽(yáng)性。

本研究顯示，PCR技術(shù)是一項(xiàng)非常有效迅速的檢測(cè)方法。將PCR技術(shù)和培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照分析，二者具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而單獨(dú)應(yīng)用PCR技術(shù)和聯(lián)合兩種常規(guī)方法檢測(cè)的結(jié)果之間對(duì)照發(fā)現(xiàn)，同樣具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在在我們的研究中，結(jié)核桿菌培養(yǎng)和PCR檢測(cè)技術(shù)存在中等水平的一致性（k=0.59）。PCR技術(shù)和結(jié)核桿菌培養(yǎng)的結(jié)果并非完全一致?？赡苁怯捎赑CR技術(shù)比常規(guī)方法的檢測(cè)診斷效果更好。本研究顯示，和其他診斷技術(shù)相比，PCR是診斷肺外結(jié)核最好的方法。

PCR技術(shù)對(duì)兩例標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為陰性，而通過(guò)常規(guī)方法檢測(cè)為陽(yáng)性。我們排除了標(biāo)本中存在PCR抑制劑的可能性，而其陰性的結(jié)果可能是由于IS6110插入序列片段復(fù)制物含量比較低的原因。目前為止，PCR技術(shù)的敏感性和結(jié)核病的診斷方面的相關(guān)理論還處于探索之中。WHO和其他健康機(jī)構(gòu)現(xiàn)今仍然推薦結(jié)核菌培養(yǎng)作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。

PCR技術(shù)在許多情況下已經(jīng)成為了一項(xiàng)常規(guī)診療程序。因?yàn)槠鋵?duì)標(biāo)本的結(jié)核分支桿菌檢測(cè)結(jié)果非?？煽俊２⑶?，比結(jié)核菌培養(yǎng)要快一到數(shù)個(gè)星期。PCR技術(shù)的敏感性和特異性和結(jié)核桿菌培養(yǎng)方法相當(dāng)，但是這種敏感性是建立在液體培養(yǎng)體系之上的。利用固體培養(yǎng)和PCR技術(shù)進(jìn)行對(duì)照是不合適的。

雖然我們總共檢測(cè)了193例標(biāo)本，但是只是對(duì)其中182例進(jìn)行了PCR檢測(cè)和常規(guī)方法檢測(cè)之間的對(duì)比研究。剩下的11例由于標(biāo)本量太小不能用常規(guī)方法檢測(cè)。其中兩例標(biāo)本PCR檢測(cè)的結(jié)果為陽(yáng)性。PCR技術(shù)對(duì)于最低量為200μl標(biāo)本均可以進(jìn)行檢測(cè)。

由于實(shí)驗(yàn)室診斷肺外結(jié)核存在困難以及沒(méi)有可供利用的金標(biāo)準(zhǔn)，因此聯(lián)合應(yīng)用現(xiàn)有幾種檢測(cè)技術(shù)用于診斷結(jié)核疾病是一個(gè)比較理想的策略，這樣可以使實(shí)驗(yàn)室為臨床工作者提供更多的信息進(jìn)行參考。

參考文獻(xiàn)

[1] Rylancea J， Pai M， Lienhardtd C， Garner P. Priorities for tuberculosis research： a systematic review. Lancet Infect Dis. 2010；10：889-92.

[2] Sharma SK， Mohan A. Extrapulmonary tuberculosis. Indian J Med Res. 2004； 120： 316-53.

[3] Katoch VM. Newer Diagnostic Techniques for Tuberculosis. Ind J Med Res . 2004；120：418-28

[4] Hillemann D， Rusch-Gerdes S， Boehme C， Richter E. Rapid Molecular Detection of Extrapulmonary Tuberculosis by the Automated GeneXpert MTB/RIF System. J Clin Microbiol. 2011；49：1202-05.

[5 Portillo-Gómez L， Morris SL， Panduro A. Rapid and efficient detection of extra-pulmonary Mycobacterium tuberculosis by PCR analysis. Int J Tuberc Lung Dis . 2000；4：361-70.

[6] Amin I， Idrees M， Awan Z， Shahid M， Afzal S， Hussain A. PCR could be a method of choice for identification of both pulmonary and extra-pulmonary tuberculosis. BMC Research Notes. 2011；4：332.