蔣可欣　林會　趙斌

摘要：試驗以水稻（Oryza sativa L.）金優(yōu)64為宿主，以4種叢枝菌根真菌Glomus mosseae、Glomus intraradices、Gigaspora margarita、Gigaspora rosea為接種劑，通過盆栽試驗研究在砷脅迫下4種叢枝菌根真菌分別與水稻金優(yōu)64共生后對水稻的促生效應。結果表明，叢枝菌根真菌與宿主之間具有選擇偏好性，水稻接種Glomus mosseae與接種其他3種叢枝菌根真菌相比，長勢較明顯，地上部砷的積累也較低。砷脅迫下接種不同種屬的叢枝菌根真菌對水稻體內砷酸鹽還原酶基因的表達影響也不同，推測砷脅迫下接種不同的叢枝菌根真菌對水稻砷代謝途徑的調控機制是不同的。

關鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；叢枝菌根真菌；共生；砷酸鹽還原酶基因；砷代謝途徑；長勢

中圖分類號：Q945.78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）16-3770-06

Abstract： Taking Jinyou 64 rice as the host plant， four kinds of arbuscular mycorrhizal fungi Glomus mosseae， Glomus intraradices， Gigaspora， margarita， Gigaspora rosea were used for the inoculum. The result of pot experiment showed that the effect of arbuscular mycorrhizal fungi symbiosis with host on rice growth was different under arsenic stress. There was a selection between arbuscular mycorrhizal fungi and the host. When rice was inoculated with Glomus mosseae， the rice growth was better and the arsenic accumulation in shoot of rice was lower compared with the other arbuscular mycorrhizal fungi symbiosis with rice. The effect of rice inoculated with arbuscular mycorrhizal fungi on the expression of arsenate reductase gene was different under arsenic stress.

Key words： rice（Oryza sativa L.）； arbuscular mycorrhizal fungi； symbiosis； arsenate reductase gene； arsenic metabolic pathways； growth

水稻（Oryza sativa L.）是中國重要的糧食作物，砷污染的地下水灌溉和土壤砷污染都會造成砷在水稻中的富集，危害人類健康。例如湖南郴州，用砷污染的地下水澆溉水稻，造成水稻子粒中砷含量高達7.5 mg/kg[1]。叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是自然界中分布極為廣泛的一類土壤真菌，能與陸地上90%的植物形成菌根共生體。玉米（Zea mays L.）和紫花苜蓿（Medicago sativa L.）接種AMF后可抑制砷向地上部的轉移，降低砷對植物地上部分的毒害作用[2]。在砷脅迫下，水稻品種LAPAR-9接種叢枝菌根真菌Glomus mosseae與不接種的相比，降低了地上部中砷的含量，有效地抑制了砷向地上部的轉移[3]。

關于砷在植物體內的吸收及代謝途徑，目前仍有很多地方尚不清楚。從目前的研究來看，砷酸鹽因其與磷酸鹽化學性質非常相似，所以主要通過磷酸鹽轉運蛋白進入植物體內，亞砷酸鹽則通過水通道蛋白進入植物體內，五價砷進入植物體內很快會被砷酸鹽還原酶還原為三價砷，三價砷與植物絡合素、谷胱甘肽等形成絡合物存儲于液泡中，以限制砷在植物體內的移動性，降低砷的毒性[4]。目前研究較為透徹的水稻砷代謝相關基因是亞砷酸鹽轉運蛋白（Lsi1、Lsi2）表達基因，其突變株會顯著降低亞砷酸鹽在水稻中的富集[5]，并且接種叢枝菌根真菌Glomus intraradices后其表達量也顯著下降[6]。Duan等[7]研究發(fā)現(xiàn)，水稻中砷酸鹽還原酶基因OsACR2有2個亞型，分別為OsACR2.1（GenBank收錄號：AY860059）、OsACR2.2（GenBank收錄號：AY860058）。

AMF可改善大部分植物對砷的耐受性，但AMF與水稻共生后能否改善水稻對砷的耐受性目前鮮有報道。本試驗主要研究了在砷脅迫下， 水稻與不同種屬的AMF共生后對水稻生長和耐砷性的影響， 以期了解AMF對水稻砷代謝相關基因的影響，從而可以更好地改善砷脅迫下水稻的種植方式， 降低水稻子粒中砷的濃度， 這對人類健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻品種為金優(yōu)64。供試AMF有Glomus mosseae、Glomus intraradices、Gigaspora margarita、Gigaspora rosea，每種AMF作為接種劑，其中含有被感染的植物根段、AM真菌菌絲、孢子和盆栽土壤混合物。

1.2 試驗設計

1.2.1 砷脅迫試驗設計 砷脅迫采用盆栽試驗，共設8個處理，其砷濃度分別為0（CK）、4、8、12、16、20、24、28 mmol/L，所用試劑為Na3AsO4·12H2O，每個處理3次重復。每盆栽種經過表面消毒及催芽5 d的水稻苗6棵。水稻苗種下后7 d內澆水，保持每個盆缽中土壤濕潤且沒有水分溢出，7 d后每2 d澆1次砷處理溶液，每次10 mL，一共澆5次，最終土壤中所加的砷濃度分別為0、60、120、180、240、300、360、420 mg/kg。21 d后收樣，檢測植物鮮重，半定量PCR檢測OsACR2.1、OsACR2.2表達量情況。

1.2.2 菌根侵染對OsACR2.1、OsACR2.2表達量的影響試驗 菌根侵染對OsACR2.1、OsACR2.2表達量的影響試驗采用盆栽試驗，共設5種接種處理，分別為不接種AMF的空白對照及接種G· mosseae、G· intraradices、G· margarita、G· rosea處理，接種量為10%（W/W）。

水稻播種后7、14、21、28、35 d取樣，采用打孔法取得新鮮的根樣，用蒸餾水將根洗凈，剪成約1 cm長，采用Trypan blue（TB）染色法進行染色，隨機挑取40條1 cm長的根段，檢測菌根侵染率。水稻播種后7、21、35 d收取植物樣品，分別提取根部和地上部的RNA，反轉錄后，半定量PCR檢測OsACR2.1、OsACR2.2表達量情況。

1.2.3 砷脅迫下接種AMF對水稻生長的影響試驗 選取上述5種接種AMF處理，每一接種處理對應3種砷處理水平（0、240、420 mg/kg）。于水稻播種后35 d分別取樣，分地上部與地下部稱取植物鮮重后將樣品置于70 ℃烘箱中烘烤48 h，稱量植物干重；取植物新鮮根樣檢測侵染率；抽取植物根部RNA檢測OsACR2.1、OsACR2.2表達量變化情況。

檢測植物根部、地上部中三價砷和五價砷的含量。將植物樣品（根部、地上部）磨碎稱重后，置于石英硝化管中，加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸（Trifluoroacetic acid，TFA），將硝化管放入加熱器中100 ℃ 6 h，之后在120 ℃將樣品混合液烘干，烘干后剩下的沉淀物用蒸餾水重新溶解，并通過0.45 μm的濾膜過濾，調pH至中性后用超純水定容至10 mL[6]。定容后的提取液通過HPLC-AFS法檢測三價砷、五價砷含量。

1.3 數據分析

所有數據采用Microsoft Excel 2003進行標準差分析，利用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同砷濃度對水稻鮮重及基因OsACR2.1、OsACR2.2表達量的影響

砷脅迫對水稻生物量的影響如圖1所示。從圖1可以看出，隨著土壤砷濃度的升高，水稻的單株鮮重降低，長勢越來越差。RT-PCR檢測結果（圖2）表明，隨著土壤砷濃度的升高，水稻根部OsACR2.1、OsACR2.2的表達量隨之上升，且OsACR2.1的表達量較OsACR2.2高；在地上部，隨著砷濃度的升高，OsACR2.1的表達量有所上升，但不如根部明顯，而OsACR2.2的表達量則很低，在砷脅迫下并沒有太明顯的表達差異。

2.2 菌根侵染率對基因OsACR2.1、OsACR2.2表達量的影響

圖3為接種不同AMF后對水稻侵染率的檢測結果，從圖3可以看出，隨著接種時間的延長，菌根侵染率也隨之升高，水稻接種不同的AMF其菌根侵染率也不一樣，其中接種G. mosseae的菌根侵染率最高，在接種35 d時已達到86.99%。

水稻接種不同AMF后，RT-PCR檢測OsACR2.1、OsACR2.2的表達量情況如圖4所示。由圖4可知，在不接種AMF的情況下，隨著水稻的生長，地上部和根部的OsACR2.1和OsACR2.2的表達量之間均無明顯差異，且OsACR2.1的表達量較OsACR2.2高，尤其在地上部，OsACR2.1的表達量明顯比OsACR2.2高。水稻根部隨著菌根侵染時間的延長，接種G· intraradices和G· rosea的OsACR2.1的表達量隨之上升，而接種G· mosseae、G· margarita的表達量與對照相比無明顯差異；而在水稻根中接種AMF的OsACR2.2的表達量與對照基本一致，無明顯差異。在地上部，菌根侵染率的增加并不影響OsACR2.1和OsACR2.2的表達，說明接種AMF并不影響OsACR2.1和OsACR2.2在地上部中的表達，因此后續(xù)試驗重點研究水稻根中OsACR2.1和OsACR2.2在砷脅迫下的基因表達差異情況。

2.3 砷脅迫下接種不同AMF對水稻生長及基因OsACR2.1、OsACR2.2表達量的影響

2.3.1 對菌根侵染率的影響 對砷脅迫下接種不同AMF的水稻的菌根侵染率進行檢測，結果如圖5所示。由圖5可知，隨著土壤中砷濃度的升高，接種G· intraradices、G· margarita、G· rosea的菌根侵染率都顯著下降，而接種G· mosseae的菌根侵染率則無顯著變化，說明土壤中砷濃度的升高并不影響G· mosseae對水稻根的侵染，而對其他3種AMF則有一定程度的影響。

2.3.2 對水稻生物量的影響 由表1可知，在不加砷時，接種G· mosseae的地下鮮重比CK1高38.30%，顯著增加，接種G· intraradices和G· margarita與CK1差異不顯著，而接種G· rosea的生物量則比CK1顯著降低，地下干重的趨勢與地下鮮重的趨勢基本一致。從地上部來看， 接種G. mosseae、G· intraradices、G· margarita的地上鮮重與CK1差異不顯著，比接種G· rosea的地上鮮重顯著增加。高砷（420 mg/kg）脅迫下，接種G· mosseae的地下鮮重比CK3高29.22%，顯著增加，接種G·intraradices、 G· margarita的地下鮮重與對照無顯著差異，而接種G· rosea的地下鮮重則比對照顯著降低。由以上結果可知，接種不同種屬的AMF對水稻生長發(fā)育的影響具有多樣性。各砷濃度脅迫下，接種G·mosseae與不接種的對照相比促進了根部的生長，地上部與不接種相比長勢略好；而接種其他3種AMF對水稻無促生效應。

2.3.3 對基因OsACR2.1、OsACR2.2表達量的影響 在砷脅迫下，接種不同AMF后對水稻根中的OsACR2.2的表達量無明顯影響，且根中OsACR2.2的表達量比OsACR2.1低（圖6）。接種AMF后OsACR2.1的表達量與對照相比有較明顯的差異，為了進一步確定其差異程度，對水稻根中OsACR2.1表達進行qPCR檢測，結果如圖7所示。由圖7可知，在正常生長條件下，即不添加砷時，接種AMF對OsACR2.1表達無明顯影響，而在高砷（420 mg/kg）脅迫下，接種G· mosseae后OsACR2.1的RNA相對轉錄量比對照低，接種G· intraradices的OsACR2.1的RNA相對轉錄量比對照要略微高一些，接種 G· margarita、G· rosea的OsACR2.1的RNA相對轉錄量與對照相比差異較明顯，推測接種不同的AMF對水稻砷代謝途徑的影響機制不同。

2.3.4 對水稻體內砷含量的影響 大部分研究結果認為， 在砷污染土壤里種植的水稻中砷含量的分布趨勢為根>莖稈>谷殼>谷粒[8]。本試驗根中砷含量的檢測結果表明，其總的無機砷的含量均很低， 即使是在高砷條件下無機砷的總含量也不超過4 mg/kg，這可能是因為砷提取方法的不同造成的。試驗為了檢測水稻組織中不同價態(tài)的砷含量，采用三氟乙酸提取法， 與常用的強酸消化法有所不同， 提取條件較為溫和， 這使得根中砷的提取效率偏低， 從而所檢測出的砷含量與實際的砷含量偏差較大， 不利于結果分析， 因此接下來主要分析地上部砷含量的變化情況。

由表2可知，在不加砷的條件下，各處理地上部的砷含量都很低， 其總的無機砷的含量均不超過4 mg/kg。高砷（420 mg/kg）脅迫下， 接種G· mosseae處理的水稻與對照相比其總砷含量較低，而接種G· intraradices、G· margarita、G· rosea處理的水稻與對照相比其總砷含量偏高。

從表2還可以看出，在地上部砷的價態(tài)主要為五價，造成這一現(xiàn)象的原因可能是：①五價砷進入根中后被砷酸鹽還原酶還原為三價砷，三價砷進一步與植物絡合素、谷胱甘肽等結合形成絡合物被固定在植物液泡中，限制了三價砷向地上部的轉運，因此在砷過量的情況下，被轉運到水稻地上部的大部分是未被還原為三價砷的五價砷；②在砷的提取過程中，因提取條件等外部環(huán)境的變化，如pH、氧化還原電位等的改變，使得三價砷在提取過程中部分被氧化為五價砷[8]。

3 討論

在砷脅迫下水稻接種不同的AMF對水稻的生長發(fā)育具有不同的影響， 從試驗結果可知， 接種G. mosseae對水稻的生長具有促生效應，尤其表現(xiàn)在提高根系的生長，而接種其他3種AMF對水稻的生長沒有明顯的促生效應，說明AMF與宿主之間具有選擇性。Christophersen等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在砷脅迫下接種G· mosseae比接種G· intraradice更有利于苜蓿的生長。水稻品種Guangyinzhan分別接種G·intraradices、G· geosporum，發(fā)現(xiàn)在砷脅迫下接種G· intraradices會促進水稻根部的生長，接種G· geosporum則對水稻根的生長沒有明顯影響，而另一水稻品種Handao 502在砷脅迫下接種G· geosporum能促進水稻根的生長，接種G· intraradices則對水稻根的生長無明顯影響[10]。可見不同水稻品種因其基因型不同與不同的AMF共生后所產生的促生效果也不一樣。

在高砷脅迫下，水稻接種不同的AMF后植株體內砷的積累量也有所不同，對于這一現(xiàn)象產生的原因則可能是因為不同種屬的AMF與水稻共生后對水稻耐砷機制的調控有所不同。在砷脅迫下接種AMF對OsACR2.2的表達無明顯影響，在不接種AMF的情況下，土壤中砷濃度的提高對其表達量的影響也沒有OsACR2.1的明顯，且OsACR2.1、OsACR2.2在大腸桿菌中超表達提取純化的蛋白，體外檢測其砷酸鹽還原酶活性，發(fā)現(xiàn)OsACR2.1的砷酸鹽還原酶活性比OsACR2.2的要高，說明在水稻體內OsACR2.2并不是最主要的砷酸鹽還原酶功能基因[7]。

砷脅迫下接種不同的AMF對OsACR2.1的表達影響也不同。推測產生這種結果的原因：①AMF本身具有一套獨特的砷代謝機制，在土壤中砷濃度過高時，砷酸鹽與磷酸鹽競爭通過磷酸鹽轉運蛋白進入到根外菌絲中，而AMF本身可將部分砷從菌絲內排出，進而降低了水稻根中五價砷的濃度，所以OsACR2.1的表達量也隨之下降。如具有砷酸鹽抗性的蘭屬菌根真菌Hymenoscyphus ericae與對照相比可將體內近90%的砷排出體外，且砷均以三價砷的形式排出[11]。最近研究發(fā)現(xiàn)， 在G· intraradices中克隆到的基因GiArsA與亞砷酸鹽的排出有關[12]。②OsACR2.1表達量的下調可能會導致砷向地上部的轉移。對擬南芥（Arabidopsis thaliana）砷酸鹽還原酶基因AtACR進行敲除，發(fā)現(xiàn)敲除AtACR后其地上部分積累的砷是野生型的10～16倍， 而根中砷的含量比野生型的低[13]。因此推測接種G. mosseae后水稻根中OsACR2.1表達量下調，促進了砷向地上部分的轉移，從而減輕了砷對根的毒害，促進了根的生長。③因砷酸鹽是通過磷酸鹽轉運蛋白進入根中，所以AMF也可能通過調控磷酸鹽轉運蛋白的表達來改變植株對砷的吸收。如大麥（Hordeum vulgare）接種G· intraradices后下調了磷轉運蛋白基因HvPht1；1、HvPht1；2的表達，而上調了基因Hv-Pht1；8的表達，且與對照相比接種G· intraradices的大麥體內砷濃度較低，降低了對砷的吸收[14]。目前水稻中共克隆到13個屬于OsPht1家族的磷酸鹽轉運蛋白，但是目前并沒有完整的關于砷脅迫下接種AMF后對整個磷酸鹽轉運體系影響的研究報告。砷脅迫下接種不同AMF對水稻砷酸鹽還原酶基因表達的影響不同，可能是由于以上原因的綜合作用，也可能是因為本試驗研究的只是砷代謝途徑中的一種酶，而并不清楚接種AMF對整個砷代謝途徑的影響，五價砷還原為三價砷只是砷代謝途徑的第一步，之后還包括三價砷的轉運和絡合等。砷酸鹽還原酶并不涉及砷酸鹽的吸收，且還原后三價砷的轉運主要與亞砷酸鹽轉運蛋白相關，接種不同的AMF可能對亞砷酸鹽轉運蛋白產生不同的影響。如水稻Nipponbare接種G· intraradices后下調了亞砷酸鹽轉運蛋白Lsi1、Lsi2的表達，降低了水稻對亞砷酸鹽的吸收[6]。絨毛草（Holcus lanatus）對砷的耐受性還與植物絡合素的積累有關，與非砷耐受性的絨毛草相比對砷超耐受的絨毛草體內植物絡合素的表達顯著上升，促進了砷在液泡內的隔離，緩解了砷的毒害作用[15]。

本試驗研究的砷酸鹽還原酶基因是砷代謝途徑的一個重要的還原酶，了解到在砷脅迫下接種不同的AMF對砷酸鹽還原酶基因表達的影響也是不同的，但是這并不能斷定接種哪一種AMF會對水稻的生長、耐砷性更好，因為砷酸鹽的還原只是砷代謝途徑中的一步，目前接種AMF對水稻整個砷代謝途徑的影響機制仍不是十分清楚，還有待進一步研究。

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（責任編輯 呂海霞）

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（責任編輯 呂海霞）