張 燕，李代禧，郭柏松，翟 振，劉 立，楊春生，余華星

(1.上海理工大學(xué)食品科學(xué)與工程研究所，上海 200093;2.上海東富龍科技股份有限公司凍干工藝研究室，上海 201108)

胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白［1］(LEA)是植物胚胎發(fā)育后期種子中大量積累的富含甘氨酸、賴氨酸、組氨酸和其他親水氨基酸的一類蛋白質(zhì)，因此，LEA蛋白具有很高的親水性以及熱穩(wěn)定性［2］。LEA蛋白的無序性使其在干燥時，能適應(yīng)熱敏性蛋白的形狀，吸附在蛋白表面，形成保護(hù)層，防止熱敏性蛋白的脫水變性、聚集變性和受熱變性［3-4］。

為了驗(yàn)證LEA蛋白的保護(hù)性，我們選擇典型的熱敏性蛋白藥物——胰島素活性單體作研究對象，第3組 LEA蛋白(AaVLEA1)［5］的特征重復(fù)片段(LEA-motif，LEAM)作為保護(hù)劑，研究 LEA-motif對熱敏性蛋白藥物的干燥活性保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

豬胰島素，醫(yī)藥級;LEA蛋白特征重復(fù)片段(LT130325-LT342888，純度 95.47%);無水硫酸鈉、乙醇胺、磷酸均為分析純。

Waters e2695高效液相色譜儀;Waters e2695分離模塊和Waters2998光電二極管檢測器;LYO-0.2凍干機(jī);XS205天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

胰島素濃度為5 mg/mL，加入LEA-motif保護(hù)劑，其與胰島素六聚體的摩爾比分別為1∶0，1∶3(即LEA-motif與胰島素單體的摩爾比為 1∶0，1∶18)。

用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。首先將藥物在－45℃預(yù)凍 1 h。然后抽真空，一次干燥溫度－35℃，干燥室內(nèi)真空度為0 Pa，干燥18 h。解析干燥溫度為25℃，直至干燥過程結(jié)束，這個過程共持續(xù)6 h。凍干結(jié)束后，用橡皮塞封玻璃瓶，保存在冰箱中。

1.3 分析方法

1.3.1 胰島素三維結(jié)構(gòu)分析 胰島素采用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的晶體結(jié)構(gòu)(3inc［6］)作為初始結(jié)構(gòu)，用Arguslab軟件構(gòu)建其三維分子模型。

1.3.2 效價分析 HPLC法［7］用十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑(4.6 mm ×250 mm，5μm);以0.2 mol/L硫酸鹽緩沖液(無水硫酸鈉28.4 g加水溶解后加磷酸2.7 mL，乙醇胺調(diào)節(jié)pH值至2.3，加水至1 000 mL)-乙腈(74∶26)為流動相;柱溫為40℃;檢測波長為214 nm;流速1 mL/min。實(shí)驗(yàn)樣品用0.01 mol/L鹽酸溶液制成40 U/mL的溶液，注入液相色譜儀20μL，記錄色譜圖。另取胰島素對照品適量，同法測定。按外標(biāo)法以峰面積計算效價［8］。

2 結(jié)果與討論

2.1 干燥前后胰島素三維結(jié)構(gòu)的變化

在干燥模擬后，在不同水分含量下，添加LEA-motif保護(hù)劑前后各個胰島素的三維活性結(jié)構(gòu)見表1。

表1 干燥后胰島素的三維結(jié)構(gòu)比較Table1 3D structures comparison of driedinsulin

由表1可知，沒有LEA保護(hù)的胰島素干燥后，整體結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化，許多疏水殘基外翻暴露于胰島素單體的分子表面，α-螺旋明顯減少，并大部分轉(zhuǎn)化為無規(guī)則卷曲和β-扭轉(zhuǎn)，三維結(jié)構(gòu)徹底變形，而且這種變性趨勢隨著干燥程度的增加而增加，這樣嚴(yán)重變性的胰島素即使在水溶液中也不可能恢復(fù)到初始三維活性結(jié)構(gòu)。然而，添加18 LEA-motif保護(hù)劑的胰島素，隨著水分含量的減少，胰島素三維活性結(jié)構(gòu)始終與初始結(jié)構(gòu)沒有明顯區(qū)別，且二級結(jié)構(gòu)也保持較好，LEA-motif對胰島素的生物活性保護(hù)效果明顯。

2.2 氨基酸殘基B因子分析

B因子也被稱為溫度因子，反映蛋白質(zhì)分子由于熱振動和構(gòu)象變化而引起的振動程度［9］。B因子越高，相應(yīng)部位的構(gòu)象就越不穩(wěn)定，表示殘基柔性越強(qiáng)［10］。圖1為胰島素主鏈上各氨基酸殘基的B因子曲線圖。

圖1 水分含量為1.77%時，胰島素主鏈B因子大小Fig.1 B-factor of insulin with water content of 1.77%

由圖1可知，在相同狀態(tài)下，β鏈上的數(shù)據(jù)跳躍更大，說明胰島素β肽鏈氨基酸殘基比α鏈上的更不穩(wěn)定，殘基柔性越強(qiáng)。未加保護(hù)劑的胰島素兩條肽鏈上的氨基酸殘基B因子變換幅度大。這都說明，在干燥過程中，未加任何保護(hù)劑的胰島素?zé)岱€(wěn)定性差，易變形。

添加LEA-motif保護(hù)劑后，B因子大小明顯降低很多，且振幅減弱，說明氨基酸殘基更加穩(wěn)定，殘基部位剛性更強(qiáng)，說明LEA-motif在干燥過程中能維持胰島素的三維活性結(jié)構(gòu)以及二級結(jié)構(gòu)，不因水分缺失而引起胰島素結(jié)構(gòu)變形。與前面分析的三維活性結(jié)構(gòu)分析一致。

2.3 胰島素體系內(nèi)氫鍵分析

圖2 水分子(A)和LEA-motif(B)分別與胰島素之間的氫鍵數(shù)目曲線圖Fig.2 H-bonding number between water(A)，LEA-motif(B)and insulin during desiccation

由圖2可知，在干燥過程中，隨著水分含量的減少，水分子與胰島素之間的氫鍵急劇減少(圖2A)，而保護(hù)劑與胰島素之間形成的氫鍵顯著增多(圖2B)，說明LEA-motif能迅速適應(yīng)缺水環(huán)境，形成適應(yīng)胰島蛋白的形狀，較好的吸附在其表面，形成保護(hù)層，保護(hù)胰島素不因缺水而受到傷害，很好地維持胰島素的活性結(jié)構(gòu)。這與水替代學(xué)說基本一致［11］。再者，蛋白質(zhì)多肽主鏈中形成的氫鍵決定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，LEA-motif保護(hù)的胰島素，主鏈間的氫鍵數(shù)目比未加任何保護(hù)劑的胰島素主鏈間的多(如圖3A)，主鏈間形成的氫鍵可以保護(hù)胰島素的二級結(jié)構(gòu)不被破壞，維持三維活性結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

另外，未加保護(hù)劑的胰島素隨水分含量的減少，其分子內(nèi)氫鍵增加顯著(圖3 B)，表明胰島素分子內(nèi)部無序連接的增大，無序連接增大會引起體積的皺縮和親水面積的減小。這些現(xiàn)象均表明其整體三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了重大變化。

圖3 胰島素主鏈間(A)和胰島素內(nèi)(B)的氫鍵數(shù)目Fig.3 H-bonding number in insulin system during desiccation

2.4 效價分析

圖4 是未加保護(hù)劑的胰島素六聚體和添加3 LEA-motif的胰島素六聚體體系(胰島素單體與LEA-motif的摩爾比為1∶18)的3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值所繪制的色譜圖。圖中第1個峰為LEA-motif特征峰，第2個峰為胰島素特征峰，峰面積大小反應(yīng)了胰島素六聚體干燥后的活性結(jié)構(gòu)保護(hù)效果。

圖4 未加保護(hù)劑胰島素和添加3 LEA-motif的胰島素干燥后的色譜圖Fig.4 HPLCcurves of various rehydrated insulin hexamer after dried

凍干胰島素與初始胰島素(初始豬胰島素經(jīng)高效液相色譜法測得的峰面積為28 146 905.67 μV·s，效價40 U)的效價比繪制的柱形圖，見圖5。

圖5 添加LEA-motif的胰島素與未加保護(hù)劑的胰島素凍干后的活性變化Fig.5 Bioactivity of dried insulin in two insulin systems

由圖5可知，未加保護(hù)劑的胰島素凍干后效價降低了12%左右，這是由于胰島素六聚體在凍干過程中，受溫度和水分的影響，活性結(jié)構(gòu)輕微發(fā)生了變化，從而引起效價降低。添加保護(hù)劑后，豬胰島素的效價比明顯提高。說明在凍干過程中，LEA-moitf對胰島素有明顯的保護(hù)效果。

3 結(jié)論

LEA-motif在干燥過程中能有效限制胰島素的有害熱運(yùn)動，很好的保護(hù)其生物活性結(jié)構(gòu)。LEA-motif保護(hù)的胰島素氨基酸殘基振動明顯降低，剛性越強(qiáng)，說明氨基酸殘基更加穩(wěn)定，胰島素結(jié)構(gòu)在保護(hù)劑的作用下得到了很好的保持，胰島素具有較高的穩(wěn)定性。這主要是隨著水分含量的減少，LEA-motif逐漸取代水分子胰島素形成氫鍵，又因?yàn)殪o電相互作用的影響，LEA-motif形成適應(yīng)胰島素的形狀，吸附在其表面，形成保護(hù)層，保護(hù)胰島素的活性結(jié)構(gòu)。LEA-motif保護(hù)的胰島素六聚體凍干后活性更好。

［1］ Zhou L，Ji X N，He F，et al.Structure and function of LEA protein in higher plants［J］.Journal of Tropical Organisms，2012，3(2):191-196.

［2］ Li J，Zhao C Y，Zhang F S，et al.LEA protein and plant stress tolerance［J］.Plant Physiology Journal，2010，46(11):1101-1108.

［3］ Goyal K，Walton L J，Tunnacliffe A.LEA proteins prevent protein aggregation due to water stress［J］.Biochemical Journal，2005，388(1):151-157.

［4］ Chakrabortee S，Boschetti C，Walton L J，et al.Hydrophilic protein associated with desiccation tolerance exhibits broad protein stabilization function［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，2007，104(46):18073-18078.

［5］ Daixi L，Xiaoming H.Desiccation induced structural alterations in a 66-amino acid fragment of an anhydrobiotic nematode late embryogenesis abundant(LEA)protein［J］.Biomacromolecules，2009，10(6):1469-1477.

［6］ Krishna R S，Pattabhi V，Rajan SS.Metal induced conformational changes in human insulin:Crystal structures of Sr2+，Ni2+and Cu2+complexes of human insulin［J］.Protein and Peptide Letters，2011，18(5):457-466.

［7］ Emami J，Hamishehkar H，Najafabadi A R，et al.A novel approach to prepare insulin-loaded poly(lactic-Co-glycolic acid)microcapsules and the protein stability study［J］.Journal of Pharmaceutical Sciences，2009，98(5):1712-1731.

［8］ State Pharmacopoeia Committee.PRC Codex［M］.Beijing:China Medical Science Press，2010:845-846.

［9］ Zhang H，Zhang T，Chen K，et al.On the relation between residue flexibility and local solvent accessibility in proteins［J］.Proteins:Structure，F(xiàn)unction，and Bioinformatics，2009，76(3):617-636.

［10］ Pan X Y，Shen H B.Robust prediction of B-factor profile from sequence using two-stage SVR based on random forest feature selection［J］.Protein and Peptide Letters，2009，16(12):1447-1454.

［11］ Golovina E A，Golovin A V，Hoekstra F A，et al.Water replacement hypothesis in atomic details:Effect of trehalose on the structure of single dehydrated POPC bilayers［J］.Langmuir，2010，26(13):11118-11126.