曾 科，周彬彬，龍一國(guó)

(1.中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410083;2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南長(zhǎng)沙 410000)

具有類花菁染料結(jié)構(gòu)的化合物具有優(yōu)越的光譜性能［1-3］，當(dāng)前已被廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)記［4-5］、熒光成像［6-8］、靶向治療等［9］諸多領(lǐng)域。同時(shí)，由于該類分子的光譜性能對(duì)周圍環(huán)境的變化異常敏感，也常被用于研究溶劑極性性質(zhì)［10-11］?；诨ㄝ碱惾玖蠈?duì)周圍化學(xué)環(huán)境敏感這一特點(diǎn)［12］，目前，采用該結(jié)構(gòu)并將其應(yīng)用于溶液pH值檢測(cè)的工作少有報(bào)道［13］。顯然，合理設(shè)計(jì)花菁染料并研究其pH響應(yīng)過(guò)程對(duì)該類分子的環(huán)境敏感行為研究具有重要意義。

本文設(shè)計(jì)合成了一種吲哚類半花菁探針，研究了該探針隨pH值變化而產(chǎn)生的光譜性質(zhì)改變以及其分子結(jié)構(gòu)的影響，并研究了其細(xì)胞毒性，希望能為該類染料在生物領(lǐng)域進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

二甲基亞砜、苯肼、3-甲基-2-丁酮、對(duì)羥基苯甲醛均為分析純。

F4600熒光分光光度計(jì);UV-2450紫外-可見分光光度計(jì);Bio-TeK ELx800型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

探針的合成路線如下:

1-乙基-2-［2-(4-羥基苯基)-乙烯基］-3，3-二甲基吲哚氫碘化物(CyP)

1.2.1 A的合成 將5 mL苯肼和15 mL 3-甲基-2-丁酮加至100 mL圓底燒瓶中，再加入冰醋酸25 mL，加熱，120℃回流反應(yīng)5 h。將反應(yīng)溶液倒入約100 g碎冰中，靜置于－20℃冰箱中2 h，取出，倒入分液漏斗，用二氯甲烷萃取，用飽和的氯化鈉溶液洗滌，用無(wú)水硫酸鈉干燥，旋蒸除去有機(jī)溶劑，用少量二氯甲烷溶解固體產(chǎn)物，用柱層析提純，以石油醚/乙酸乙酯(v/v)=6∶1的混合溶劑作為淋洗液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去淋洗液，得到中間產(chǎn)物A，產(chǎn)率80%。

1.2.2 B的合成 將4 g中間產(chǎn)物A和9 g碘乙烷溶于約60 mL無(wú)水乙腈中，加熱回流過(guò)夜。將反應(yīng)溶液冷卻至室溫，有固體析出，旋蒸除去乙腈，固體用乙酸乙酯淋洗，除去未反應(yīng)的雜質(zhì)，得到白色固體B。

1.2.3 CyP的合成 將0.2 g的中間產(chǎn)物 B和0.55 mmol對(duì)羥基苯甲醛溶于約20 mL無(wú)水乙醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流12 h。旋蒸除去乙醇，用少量二氯甲烷溶解得到固體產(chǎn)物，用柱層析提純，以二氯甲烷/甲醇(v/v)=10∶1的混合溶劑作為淋洗液，得到探針 CyP。1H NMR(500 MHz，DMSO)δ10.88(1H，s)，8.42(1H，d，J=16.1)，8.16(2 H，d，J=8.8)，7.89 ～7.85(2H，m)，7.64 ～7.56(2H，m)，7.48(1H，d，J=16.1)，6.97(2H，d，J=8.8)，4.66(2H，q，J=7.2)，1.78(6H，s)，1.43(3H，s)。

1.3 工作溶液的配制

稱取適量的探針CyP，溶于二甲亞砜(DMSO)中，配制成濃度為25 mmol/L的儲(chǔ)存液。將適量?jī)?chǔ)存液加入到濃度為10 mmol/L的不同pH值的緩沖溶液(pH為3～6，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液;pH為6～9，磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖溶液;pH為9～10.5，碳酸氫鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液)中，得到DMSO含量5%(v/v)，CyP探針濃度為10μmol/L的工作溶液，用于紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的測(cè)定。

1.4 干擾金屬陽(yáng)離子的溶液配制

在10 mmol/L，pH=5.6 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，分別配制金屬離子濃度為20 mmol/L(NaCl，KCl)和 50 μmol/L(MgCl2，CaCl2，Zn(NO3)2，CuCl2，AgNO3，BaCl3，SnCl2)的測(cè)試溶液，用于離子干擾實(shí)驗(yàn)的熒光光譜測(cè)定。

1.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用四唑鹽比色法 (MTT法)，對(duì)CyP探針的體外細(xì)胞毒性進(jìn)行研究。

(1)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞株，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，取每孔100μL接種于96孔培養(yǎng)板上，調(diào)整細(xì)胞懸浮液濃度至5×103cells/孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜。

(2)含CyP的培養(yǎng)液的配制:用含有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制一系列不同濃度的含CyP的培養(yǎng)液。待細(xì)胞貼壁后，吸棄舊的培養(yǎng)液，向每孔100μL含CyP的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置只加培養(yǎng)液的調(diào)零孔和只加細(xì)胞懸浮液、不加CyP的對(duì)照孔。CyP設(shè)有6個(gè)濃度梯度，分別為0.1，0.5，5，10，50，150 μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。達(dá)到指定的培養(yǎng)時(shí)間后，每孔加入含有MTT且濃度為5 mg/mL的培養(yǎng)液200μL，再向每個(gè)孔中加入100μL的DMSO，溶解紫色結(jié)晶。用Bio-TeK ELx800型的酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔的吸光度OD，選490 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，以635 nm作為參考波長(zhǎng)，重復(fù)測(cè)3次。以不加CyP的細(xì)胞作為對(duì)照組，計(jì)算不同CyP濃度組的細(xì)胞生長(zhǎng)存活率。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針溶液紫外-可見吸收光譜分析

探針溶液紫外-可見吸收光譜分析，見圖1。

圖1 在DMSO/緩沖溶液(DMSO 5%，v/v)中，探針的紫外吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra with pH increase from 2.6 to 9.5

由圖1可知，在較低pH情況下(pH ＜5)，探針溶液的紫外吸收光譜僅在422 nm處有吸收峰，當(dāng)pH逐漸增大(pH ＞5)，該處吸收峰的強(qiáng)度逐漸降低，同時(shí)在525 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，隨著pH增大，525 nm處吸收峰值逐漸增大，當(dāng) pH=9.5時(shí)，525 nm處吸收峰達(dá)到最大值。同時(shí)，探針溶液在457 nm處有等吸收點(diǎn)，意味著探針在酸堿環(huán)境下，存在著兩種狀態(tài)的平衡。整個(gè)變化過(guò)程紫外光譜出現(xiàn)了明顯的紅移(約100 nm)，所以當(dāng)pH由5上升至8時(shí)，溶液的顏色由亮黃色轉(zhuǎn)變?yōu)槌壬?，最終變?yōu)榧t色，且變化非常明顯。這意味著該探針同時(shí)具有裸眼檢測(cè)的潛在應(yīng)用價(jià)值。

2.2 探針熒光光譜的分析及其p K a值計(jì)算

當(dāng)波長(zhǎng)為430 nm激發(fā)光激發(fā)時(shí)，探針在pH4.8～8.4范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜見圖2。

圖2 在DMSO/緩沖溶液(DMSO 5%，v/v)中，探針的熒光發(fā)射光譜(λex=430 nm)Fig.2 Fluorescence emission spectra with pH increase from 4.8 to 8.4(λex=430 nm)

由圖2可知，隨著pH升高，513 nm處熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸下降，至pH=8.4時(shí)完全消失，同時(shí)在550～560 nm處熒光發(fā)射峰逐漸上升。取兩熒光峰513 nm處的熒光強(qiáng)度與553 nm處的熒光強(qiáng)度的比值(I513nm/I553nm)，考察其與pH的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在pH 5.4～7.2 范圍內(nèi)，I513nm/I553nm的值與 pH 值有良好的線性關(guān)系(見圖 2，R2=0.990 23)，說(shuō)明在 pH 5.4～7.2范圍內(nèi)可以通過(guò)513 nm與553 nm熒光強(qiáng)度的比值檢測(cè)溶液的pH。

波長(zhǎng)為520 nm激發(fā)光激發(fā)時(shí)，熒光發(fā)射光譜見圖3，當(dāng)pH ＜4.3時(shí)，探針溶液無(wú)明顯的熒光發(fā)射峰，當(dāng)pH ＞4.3時(shí)，在560 nm處出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射峰，隨著pH增大，發(fā)射峰強(qiáng)度明顯增大，至pH=8時(shí)達(dá)到最大值。根據(jù)亨德森-哈塞爾巴爾赫方程，通過(guò)對(duì)不同pH值下560 nm處發(fā)射峰強(qiáng)度的計(jì)算，得出該探針溶液的p Ka值約為6.25(見圖3C)。同時(shí)探針在pH 6.0～7.2范圍內(nèi)560 nm處峰強(qiáng)度與pH值有較好的線性關(guān)系。

圖3 在DMSO/緩沖溶液(DMSO 5%，v/v)中，探針的熒光發(fā)射光譜(λex=520 nm)Fig.3 Fluorescence emission spectra with pH increase from 3.4 to 7.7(λex=520 nm)

2.3 探針的選擇性分析

選取常見金屬離子作為干擾物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析。待測(cè)陽(yáng)離子種類及濃度為 Na+，K+(50 mmol/L)，Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Ag+、Ba2+、Sn2+(50 μmol/L)，緩沖液 pH=5.4，結(jié)果見圖4。

圖4 探針對(duì)常見陽(yáng)離子的選擇性Fig.4 Selectivity of the probe for common cation

由圖4可知，在相同pH情況下，不同陽(yáng)離子的加入，對(duì)探針I(yè)513nm/I553nm熒光強(qiáng)度的比值基本無(wú)影響，說(shuō)明該探針可在不同的離子環(huán)境下對(duì)pH的變化進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 探針的細(xì)胞毒性分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該探針具有在生物體內(nèi)檢測(cè)pH值的可能，我們首先對(duì)探針的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究，將不同濃度的探針與HeLa細(xì)胞培養(yǎng)48 h，結(jié)果見圖5。

圖5 探針與HeLa細(xì)胞培養(yǎng)48 h的細(xì)胞存活率Fig.5 Cell viability of probe against HeLa cells at various probe concentration after 48 h

由圖5可知，隨著探針濃度的增加，HeLa細(xì)胞的存活率略微下降，當(dāng)培養(yǎng)濃度遠(yuǎn)大于工作濃度時(shí)(100μmol/L)，細(xì)胞存活率仍大于80%，說(shuō)明該探針具有較高的生物相容性，對(duì)細(xì)胞的毒副作用較小。因此，該探針具有較好的體內(nèi)應(yīng)用價(jià)值。

2.5 檢測(cè)機(jī)理討論

該探針的檢測(cè)機(jī)理見圖6，當(dāng)pH ＜4.3時(shí)，探針?lè)肿又械姆恿u基處于未解離狀態(tài)，此時(shí)分子骨架整體電子云極化度較小，呈現(xiàn)強(qiáng)度較弱的短波長(zhǎng)熒光發(fā)射，當(dāng)pH ＞4.3時(shí)，探針?lè)肿又械姆恿u基氫發(fā)生解離，結(jié)構(gòu)變?yōu)榉友踟?fù)離子，該結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的供電能力，與吲哚環(huán)上的正電荷構(gòu)成D-π-A結(jié)構(gòu)，此時(shí)分子骨架整體電子云極化度變大，產(chǎn)生ICT效應(yīng)，使得分子熒光發(fā)射光譜向長(zhǎng)波長(zhǎng)移動(dòng)，波長(zhǎng)560 nm處出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射峰。隨著pH值升高，溶液中電離的分子比例加大，至pH=8時(shí)，全部電離，該處熒光發(fā)射峰強(qiáng)度達(dá)到最大值。同時(shí)，溶液的顏色由酸性條件下的亮黃色轉(zhuǎn)變?yōu)槌壬?，最終變?yōu)閴A性條件下的紅色。

圖6 探針檢測(cè)機(jī)理及不同pH下的溶液顏色對(duì)比Fig.6 Detection mechanism of CyP and the color change at different pH

為進(jìn)一步驗(yàn)證反應(yīng)的pH響應(yīng)機(jī)制，采用密度泛函理論對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了初步模擬計(jì)算。對(duì)化合物在酸性條件下存在形式(F1型結(jié)構(gòu))及其堿性條件下存在形式(F2型結(jié)構(gòu))進(jìn)行了優(yōu)化，其優(yōu)化的結(jié)構(gòu)表明相比F1的羥基結(jié)構(gòu)，F(xiàn)2的酚氧負(fù)離子結(jié)構(gòu)更易于異構(gòu)化為吸收及發(fā)射光譜波長(zhǎng)較長(zhǎng)的酮式結(jié)構(gòu)F3。結(jié)構(gòu)F1的HOMO和LUMO軌道能級(jí)均較結(jié)構(gòu)F3低，且其能級(jí)差小于結(jié)構(gòu)F3(見表1)，這種趨勢(shì)與光譜波長(zhǎng)的移動(dòng)是一致的。從C—O鍵的鍵長(zhǎng)方面比較，在結(jié)構(gòu)F1中，C—O鍵長(zhǎng)高于結(jié)構(gòu)F3中的C—O鍵長(zhǎng)，說(shuō)明結(jié)構(gòu)F3中電荷分布更為均勻，能級(jí)更低。

由此，我們認(rèn)為在pH較高的條件下，結(jié)構(gòu)F1容易失去質(zhì)子變?yōu)榉友踟?fù)離子，同時(shí)，發(fā)生異構(gòu)化，轉(zhuǎn)變?yōu)槲占鞍l(fā)射光譜波長(zhǎng)較長(zhǎng)的酮式結(jié)構(gòu)F3(見圖7)。這一過(guò)程導(dǎo)致了不同pH條件下的光譜差異。

表1 F1，F(xiàn)3結(jié)構(gòu)的密度泛函理論計(jì)算結(jié)果(HOMO，LUMO及C—O鍵長(zhǎng))Table 1 Result of DFT with HOMO，LUMO and C—O bond length

圖7 探針的密度泛函理論優(yōu)化分子結(jié)構(gòu)(左F1，右F3)Fig.7 DFT optimized structures of CyP F1(phenol configuration，left)，F(xiàn)3(enol configuration，right)

3 結(jié)論

設(shè)計(jì)合成了一種用于檢測(cè)pH值的比值式熒光探針，研究了探針在溶液中隨pH值變化所產(chǎn)生的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜變化，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為430 nm時(shí)，其發(fā)射峰強(qiáng)度的比值I513nm/I553nm的變化與pH值(pH 5.4～7.2)具有良好的線性關(guān)系，且探針溶液的顏色隨pH值變化有明顯改變，并對(duì)探針的響應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了理論計(jì)算和探討。同時(shí)對(duì)探針的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)探針在工作濃度下具有較低細(xì)胞毒性的特性。因此該探針有進(jìn)一步應(yīng)用于體內(nèi)檢測(cè)生物體內(nèi)pH值的潛在應(yīng)用價(jià)值。

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