林 榮 王 彬 劉燕飛

浙江省溫州市中心血站，浙江溫州 325000

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是黃病毒科肝炎病毒，為RNA正鏈病毒[1]。鑒于HCV基因組的變異性較大，故HCV存在不同的基因型。目前，根據(jù)Simmonds分型系統(tǒng)共有6個基因型，68個亞型。我國主要以 1a、1b、2a、2b、3a 基因型為主，且均有相關(guān)報道文獻(xiàn)[2]。我國HCV感染率較高，平均為3.2%，該類感染可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化、肝癌等病癥，其臨床癥狀的輕重程度與感染基因型相關(guān)，一般1b型較非1b型肝功能損害病情嚴(yán)重，易惡化[3-5]。因此，對HCV感染區(qū)分基因分型對于丙型肝炎的個體化治療作用明顯。本研究采用PCR技術(shù)對溫州地區(qū)HCV感染者進(jìn)行基因型研究，了解本地區(qū)患者主要基因型，以探討HCV基因型的分布特征，并分析基因型與病情的關(guān)系，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集 2010年 1月～2012年 12月溫州市中心血站（以下簡稱“我站”）自愿獻(xiàn)血者244例，經(jīng)ELISA方法證實HCV抗體陽性者122例，年齡23～56歲，其中男 68例，女 54例；健康者 122例，年齡 20～58歲，其中男70例，女52例。收集同期溫州某醫(yī)院門診患者122例，其中，輸血后丙肝 14例，男 4例，女 10例，年齡15～64歲；散發(fā)性丙肝 25例，男 15例，女 10例，年齡 17～60歲；肝硬化 40例，男 27例，女 13例，年齡11～69歲；原發(fā)性肝癌 43例，男 21倒，女 22例，年齡23～68歲。采集靜脈血，全部血清標(biāo)本均來自我站檢驗科及醫(yī)院門診患者。所有患者診斷均符合2000年9月西安第10次全國傳染病與寄生蟲病和肝病學(xué)術(shù)會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》的標(biāo)準(zhǔn)：血清抗-HCV陽性、HCV RNA＞80 copies/mL，伴或不伴肝功能異常，均伴有不同程度的肝硬化。兩組研究對象年齡、性別比例等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。且研究對象均知情同意，已經(jīng)我站業(yè)務(wù)科通過。

1.2 試劑

全血RNA提取試劑盒（北京艾比根生物技術(shù)有限公司）；HCV抗體診斷試劑盒（北京科美東雅生物技術(shù)有限公司）；Taq酶、引物、RNA酶抑制劑（上海玉博生物科技有限公司）；M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Simga公司）。

1.3 方法

1.3.1 PCR引物設(shè)計 自Genebank中查找HCV 1a、1b、2b、3a型全序列，查找各型 5′UTR 區(qū)共同序列，并以此自行設(shè)計引物。 外引物：S1 （nt34～54）：5′-ATCACTCCCCTGTGAGGAAC-3′；S2（nt279～299）：5′-CCCTATCAGGCAGTACCACA-3′；內(nèi)引物：S3（nt39～59）：5′-TCCCCTGTGAGGAACTACTG-3′；S4 （nt274～294）：5′-TCAGGCAGTACCACAAGGCC-3′。

1.3.2 HCV RNA提取及AMV反轉(zhuǎn)錄 所收集的血清，12 000 r/min離心10 min，取上清，-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。利用Trizol法提取備用血清中的病毒RNA，具體操作方法為：于 30 μL血清中加入 Trizol溶液、氯仿及異丙醇，預(yù)冷振蕩并洗滌，所得RNA于-70℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。另外在EP管中依次加入模板RNA、oligo（dT）16、dNTPmixture、RNase Inhibitor、AMV及 DEPC水，混勻均勻，42℃保溫 1 h，95℃保溫 5 min后冰上冷卻后，行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.3 巢式PCR擴增和酶切反應(yīng) 于EP管中分別加入 cDNA 模板，Taq DNA 聚合酶，10×PCR buffer，上游引物（25 mmol/L）、下游引物 1μL，dNTP，滅菌去離子水，行擴增，并于 95℃預(yù)變性 4 min，95℃變性 30 s，55℃退火 30 s，70℃延伸 30 s，70℃延伸 5 min，進(jìn)行35個循環(huán)后得到第1輪擴增產(chǎn)物。以其為模板，等同條件下行第2輪擴增。取第2輪PCR產(chǎn)物，分別加入19.5 μL Hae Ⅲ和 Bsh 1236Ⅰ及 buffer溶液，37℃水浴2 h，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，等級資料采用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-巢式PCR檢測HCV-RNA結(jié)果

1b 陽性（144 bp）、2a陰性表達(dá)；1b 陰性、2a陽性（174 bp）表達(dá)；1b 陽性（144 bp）、2a 陽性（174 bp）表達(dá)，見圖1。

圖1 溫州地區(qū)HCV分型凝膠電泳圖

2.2 HCV-RNA基因分型結(jié)果

結(jié)果顯示，所有研究對象中，門診肝病患者1b總陽性率為100.0%，HCV抗體陽性者1b總陽性率為95.9%，健康者1b總陽性率為0.0%，三者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.28，P ＜0.05），提示該地區(qū) 1b基因型所占比例較大。見表1。

2.3 基因型與患者病情的關(guān)系

以門診患者不同病變程度占比進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，122例患者中1b型所占比例最高，且主要分布在重度病變及肝硬化患者中（P＜0.05），不同程度間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示1b型感染所致疾病病情較為嚴(yán)重。見表2。

表1 HCV-RNA基因分型結(jié)果[n（%）]

表2 基因型與患者病情的關(guān)系

3 討論

HCV基因組變異明顯，分型較多，平均每個位點的核苷酸變異頻率每年可達(dá)0.001[6-7]。HCV不同基因型可影響患者的病情及其進(jìn)展。本研究利用較為保守的5′UTR區(qū)進(jìn)行RFLP法分型，對1a～6a不同基因型的cDNA擴增效果較為明顯。不同地區(qū)的HCV基因分布不同，歐美國家主要為1a型，亞洲國家主要為1b型[8]。文獻(xiàn)顯示，1b基因型對疾病的影響較為嚴(yán)重，可導(dǎo)致肝壞死及纖維化，且該類病毒的復(fù)制能力較強，危險系數(shù)較大[9]。

HCV基因型分布存在地區(qū)差異。研究報道我國南方沿海城市1b型占90%以上，北方城市2a型占62%左右[10-11]。HCV包括多種基因型，將Okamoto和Simmonds提出的兩種分類方法結(jié)合起來可以把HCV基因型分為Ⅰ/1a、Ⅱ/1b、Ⅲ/2a、Ⅳ/2b、Ⅴ/3a、4a、4b、4c、4d、5a和Ⅵ/6a，其中Ⅱ/1b和Ⅲ/2a是我國主要流行的基因型。人感染HCV后機體不產(chǎn)生保護(hù)性抗體，另外針對HCV感染也缺少有效的治療藥物。雖然干擾素是目前公認(rèn)的抗HCV的有效藥物，但是，國內(nèi)外的研究資料表明，HCV基因型對干擾素有明顯影響[7-8]。因此，在干擾素治療前，提前測定患者所感染HCV的基因型對于治療非常重要。另外，人感染HCV以后，肝臟疾病的嚴(yán)重程度也各異，這與所感染的HCV基因型也有關(guān)，所以研究HCV不同血清型在人群中分布情況可以為HCV的診斷和治療等方面提供重要的科學(xué)依據(jù)。我國其他地區(qū)雖然進(jìn)行了HCV基因型分布的探討，但是在溫州地區(qū)還未開展。關(guān)于浙江溫州地區(qū)HCV不同基因型分布情況相關(guān)的研究不多。本研究結(jié)果顯示，所有研究對象中，門診肝病患者1b型總陽性率為100.0%，HCV抗體陽性者1b型總陽性率為95.9%，健康者1b型總陽性率為0.0%，三者比較，差異顯著（P＜0.05），提示該地區(qū) 1b型所占比例較大。122例肝病患者中1b型所占比例最高，且主要分布在重度病變及肝硬化患者中（P＜0.05），不同程度間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示，1b型有較高的復(fù)制能力和血清反應(yīng)性，較強的肝細(xì)胞損害作用及較低的IFN治療反應(yīng)性等，由其感染所致疾病病情較為嚴(yán)重，HCV基因型與特定的組織病理學(xué)程度、肝臟炎癥程度相關(guān)。

綜上所述，本研究在一定程度上反映了溫州地區(qū)HCV基因型分布情況，對當(dāng)?shù)乇透窝谆颊叩闹委熀皖A(yù)后判斷有一定的指導(dǎo)意義。但由于本研究對象例數(shù)不多，還不能完全反映溫州地區(qū)HCV不同基因型具體分布情況，且研究對象以慢性肝病為主，缺乏無癥狀患者，有必要擴大樣本量，選擇人群資料進(jìn)一步研究。

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