許 華 王 建 王遲鵑 張麗媛 常國強(qiáng) 藺亞妮 張洪菊 張玉娟 張海瑞李慶華 龐天翔

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所 血液病醫(yī)院 實驗血液學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，天津 300020；2.天津市第四中心醫(yī)院急診科，天津 300140

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為慢性、對稱性、進(jìn)行性多關(guān)節(jié)炎[1]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征，反復(fù)持久發(fā)作，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨破壞，關(guān)節(jié)功能障礙，甚至殘廢。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病呈全球性分布，我國的發(fā)病率為0.32%～0.36%[2]。目前副作用較小的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物不多，相關(guān)藥物還有待于進(jìn)一步研究。

含笑內(nèi)酯（micheliolide，MCL）是近幾年研究者從70多種藥物中篩選出來的一種小分子化合物，其主要成分為倍半萜內(nèi)酯[3]，它可以用小白菊內(nèi)酯為原料，在一定的溶劑和溫度下反應(yīng)得到[4]。含笑內(nèi)酯衍生于小白菊內(nèi)酯，其活性與小白菊內(nèi)酯相當(dāng)，但它在血漿中穩(wěn)定性比小白菊內(nèi)酯高，成本比小白菊內(nèi)酯低[5]，因此更適于作為臨床藥物研究。在此次研究中，筆者構(gòu)建了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎DBA/1小鼠模型，并用MCL和MTX來治療小鼠，從而探究MCL對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療效果是否可靠。同時應(yīng)用蛋白芯片，檢測MTX治療后小鼠血清中細(xì)胞因子的變化?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DBA/1小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司；牛Ⅱ型膠原、費(fèi)氏完全佐劑、費(fèi)氏不完全佐劑購自chondrex公司；MCL由南開大學(xué)藥學(xué)院陳悅教授提供；甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）注射液購自山西普德藥業(yè)股份有限公司，DMSO購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，小鼠細(xì)胞因子檢測試劑盒購自R&D公司。

1.2 構(gòu)建類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎DBA/1小鼠模型

訂購 40只 SPF級 DBA/1小鼠，6周齡，雄性；SPF級飼養(yǎng)1周，讓小鼠熟悉環(huán)境，對小鼠進(jìn)行編號并隨機(jī)分為四組：空白對照組（Nor組）、模型對照組（Con組）、甲氨蝶呤治療組（MTX組）和實驗組（MCL組），每組10只。其中Nor組小鼠不作任何處理，對其他三組小鼠進(jìn)行造模：將2 mg/mL牛Ⅱ型膠原與1 mg/mL費(fèi)氏完全佐劑等體積混合乳化，使得牛Ⅱ型膠原終濃度為1 mg/mL。對7周齡小鼠進(jìn)行初次免疫，每只小鼠尾根部皮下注射100 μL牛Ⅱ型膠原的費(fèi)氏完全佐劑混合液，并記為造模第0天；在造模第21天，將100 μL含100 μg牛Ⅱ型膠原的費(fèi)氏不完全試劑混合液注入小鼠尾根部皮下，進(jìn)行加強(qiáng)免疫[2,6-7]。

1.3 給藥觀察

造模第22天開始對三組造模小鼠進(jìn)行腹腔注射給藥，根據(jù)前期預(yù)實驗的結(jié)果確定MCL組給予溶解于 DMSO的 MCL藥物濃度為30 mg/kg，MTX組給予溶于生理鹽水的MTX的濃度為6.6 mg/kg[8]，Con組注射等量的溶劑DMSO，隔天給藥，給藥28 d。造模第23天開始隔天對小鼠進(jìn)行體重檢測和關(guān)節(jié)炎癥狀評價。其中關(guān)節(jié)炎癥狀評價包括前后抓足掌厚度測定和關(guān)節(jié)炎評分兩方面。關(guān)節(jié)炎評分標(biāo)準(zhǔn)：正常為0分；輕微的但有明確的發(fā)紅和腕關(guān)節(jié)或踝關(guān)節(jié)發(fā)炎為1分；中等程度的發(fā)紅和腕關(guān)節(jié)或踝關(guān)節(jié)發(fā)炎為2分；整個爪子包括腳趾嚴(yán)重的發(fā)紅發(fā)炎記為3分；涉及多關(guān)節(jié)，四肢的最大程度的紅腫、關(guān)節(jié)變形、功能損傷為4分。四只爪子得分相加為小鼠關(guān)節(jié)炎總評分[9]。

1.4 眼球取血分離血清

給藥停止后繼續(xù)隔日觀察8 d，對小鼠進(jìn)行摘除眼球采血，分離血清并保存于-20℃。

1.5 制備病理標(biāo)本

解剖小鼠，取爪子、膝蓋，剔除結(jié)締組織、肌肉組織，浸泡在4%甲醛溶液中進(jìn)行組織固定，石蠟包埋，切片，HE染色，封片，病理分析，選取爪關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)進(jìn)行半定量評分。每個關(guān)節(jié)的半定量評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分：關(guān)節(jié)具有正常的結(jié)構(gòu)，如關(guān)節(jié)間隙、軟骨、骨以及滑膜組織等；1分：關(guān)節(jié)組織中有纖毛形成和輕度的關(guān)節(jié)炎癥并有滑膜增生，血管數(shù)量增加，以及小的炎癥細(xì)胞灶，無軟骨和骨的侵蝕破壞；2分：關(guān)節(jié)有軟骨的侵蝕破壞，中度的關(guān)節(jié)炎癥，大量的炎癥細(xì)胞浸潤，滑膜細(xì)胞增生、血管翳形成較嚴(yán)重，骨和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)無破壞；3分：有嚴(yán)重的血管翳形成，廣泛的軟骨侵蝕破壞，可見骨破壞，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞[10-11]。

1.6 血清內(nèi)細(xì)胞因子檢測

取硝酸纖維素膜浸泡，水平振蕩封閉1 h；取1 mL樣品混勻，每個樣品管內(nèi)加15 μL檢測抗體混合液并在室溫下孵育1 h；將硝酸纖維素膜浸泡在樣品與抗體混合液中4℃孵育過夜，漂洗3次，室溫下二抗孵育30 min，漂洗3次，化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像儀對結(jié)果掃描。根據(jù)說明書用photoshop圖像分析軟件計算平均像素值，三組模型組的平均像素值與Nor組進(jìn)行比值分析作為細(xì)胞因子的表達(dá)量值，每個樣本至少重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件GraphPad Prism 5對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎DBA/1小鼠模型的構(gòu)建

實驗中對DBA/1小鼠進(jìn)行造模實驗，小鼠均在造模第29天開始相繼發(fā)病，造模成功率為93%。

2.2 DBA/1小鼠體重檢測

通過對四組小鼠體重情況的檢測發(fā)現(xiàn)，各組小鼠的體重之間均未見明顯差異且隨著實驗的進(jìn)行，單只小鼠的體重也未見明顯變化。且未發(fā)現(xiàn)MCT對DBA/1小鼠的毒性作用和生活狀態(tài)的不良影響。見表1。

表1 體重檢測結(jié)果（g，±s，n=10）

表1 體重檢測結(jié)果（g，±s，n=10）

組別 只數(shù) 第29天 第37天 第45天 第53天 第61天 第69天 第77天 第85天Nor組1019.93±1.9520.19±1.8720.48±2.1320.69±1.9020.17±2.0621.76±2.1022.205±1.8922.38±2.05 Con組1019.72±1.5720.45±1.3919.82±1.2719.81±1.0819.91±0.5220.28±0.3920.39±0.7719.65±0.68 MTX組820.90±0.8321.38±0.7121.23±0.8420.76±0.6321.56±0.9021.36±0.8321.68±0.6021.58±0.61 MCL組1020.14±0.5620.08±0.7519.75±1.4119.08±1.1819.39±1.1419.41±1.1820.86±1.0020.08±1.42

2.3 DBA/1關(guān)節(jié)炎評價檢測

通過對三組造模小鼠的足掌厚度變化和關(guān)節(jié)炎評分的觀察顯示，小鼠大多在造模第29天開始發(fā)病，紅腫癥狀多見于后肢趾間關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)并累及前肢，其中MTX組關(guān)節(jié)炎評價得分在三組中最低，Con組的得分最高，MCL組的得分處于中間位置。結(jié)果表明MCL對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有一定的治療作用。見表2、3。

表2 足掌厚度檢測結(jié)果（cm，±s，n=10）

表2 足掌厚度檢測結(jié)果（cm，±s，n=10）

組別 只數(shù) 第29天 第37天 第45天 第53天 第61天 第69天 第77天 第85天Nor組100.408±0.0230.398±0.0140.398±0.0310.393±0.0120.404±0.0200.407±0.0220.407±0.0220.409±0.021 Con組100.401±0.0140.431±0.0270.490±0.0360.507±0.0680.556±0.0690.595±0.0850.630±0.0950.681±0.102 MTX組80.400±0.0270.400±0.0270.436±0.0180.477±0.0690.503±0.1040.510±0.1050.541±0.1250.566±0.141 MCL組100.397±0.0280.497±0.0220.442±0.0210.455±0.3220.477±0.0200.503±0.0300.548±0.0580.560±0.073 P值 ＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

表3 關(guān)節(jié)炎評分結(jié)果（分，±s，n=10）

表3 關(guān)節(jié)炎評分結(jié)果（分，±s，n=10）

組別 只數(shù) 第29天 第37天 第45天 第53天 第61天 第69天 第77天 第85天Nor組1000000000 Con組1002.00±1.554.50±1.055.00±2.005.83±2.406.67±2.338.00±3.1010.17±2.91 MTX組8002.17±1.332.83±1.404.00±1.894.33±1.095.67±1.106.17±1.72 MCL組1002.50±2.073.83±1.174.17±0.755.17±1.176.33±0.827.67±1.038.33±1.86 P值 ＞0.05＞0.05＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

2.4 病理分析結(jié)果

對四組小鼠的爪子，膝蓋進(jìn)行石蠟包埋，HE染色處理后觀察到Nor組未見明顯變化；Con組的切片顯示滑膜細(xì)胞增生明顯，呈多層細(xì)胞，排列紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤（圖1D），有炎性肉芽組織形成，纖維母細(xì)胞、毛細(xì)血管增生（圖1E），纖維組織增生與關(guān)節(jié)軟骨粘連，關(guān)節(jié)周圍組織大量炎癥細(xì)胞浸潤，有的小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)有壞死組織出現(xiàn)（圖1F），病理評分結(jié)果為（4.25±0.25）分；NTX治療的MTX組病理結(jié)果為關(guān)節(jié)滑膜炎癥細(xì)胞浸潤，纖維組織增生（圖1G），關(guān)節(jié)周圍組織炎癥細(xì)胞浸潤（圖1H），關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎癥細(xì)胞及變性組織（圖1I），病理評分結(jié)果為（1.75±0.50）分；而含笑內(nèi)酯治療的MCL組小鼠結(jié)果顯示與MTX組結(jié)果類似為關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎癥細(xì)胞和變性組織（圖1J），關(guān)節(jié)軟骨未見明顯改變，滑膜細(xì)胞增生、腫脹，滑膜炎癥細(xì)胞浸潤（圖1K），關(guān)節(jié)周圍組織炎癥細(xì)胞浸潤（圖1L），病理評分結(jié)果為（2.00±0.81）分。Con組、MTX 組與 MCL 組三組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 血清內(nèi)細(xì)胞因子檢測結(jié)果

四組小鼠血清中檢測出C5/C5a、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子（TIMP-1）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、可溶性細(xì)胞黏附因子（sICAM-1）、干擾素-γ（IFN-γ）和B細(xì)胞趨化因子（BLC）等6種細(xì)胞因子。C5/C5a和M-CSF在Con組的表達(dá)量最低，在MTX組的表達(dá)量最高而在MCL組中的表達(dá)量則處于Con組和MTX組之間；TIMP-1在MCL組和MTX組的表達(dá)量均比Con組高與Nor組水平相當(dāng)略偏高；sICAM-1結(jié)果為MCL組最低；IFN-γ只在Nor組有顯示、BLC只顯示在MCL組，該兩種細(xì)胞因子未標(biāo)注在定量分析圖上。四組小 鼠 血 清 中 檢 測 出 C5/C5a、TIMP-1、M-CSF、sICAM-1、IFN-γ 和 BLC等細(xì)胞因子，依次編號為 1～6。MCL組與Con組比較C5/C5a表達(dá)量增高（P＜0.01）；MCL組與MTX組比較，C5/C5a表達(dá)量也增高（P＜0.01）；MCL組和MTX組與 Con組比較，TIMP-1表達(dá)量均增高（P＜0.01）；MCL組與 MTX組比較 M-CSF表達(dá)量較低 （P＜0.01）；MCL組與Con組比較，M-CSF表達(dá)量增高（P＜0.01）；sICAM-1在MCL組中表達(dá)量最低，MCL組與MTX組比較，sICAM-1表達(dá)量降低（P＜0.01）；MCL組與Con組比較，sICAM-1表達(dá)量降低（P＜0.01）；IFN-γ只在 Nor組有表達(dá)；BLC只表達(dá)于 MCL組。結(jié)果見表3、圖2。

圖1 關(guān)節(jié)組織HE染色結(jié)果

表3 細(xì)胞因子檢測結(jié)果像素分析值（±s）

表3 細(xì)胞因子檢測結(jié)果像素分析值（±s）

注：依據(jù)芯片說明書將Nor組的細(xì)胞因子像素值視為1，表中結(jié)果為其他各組的相應(yīng)細(xì)胞因子像素值與Nor組做比值分析所得；與Con組比較，△△P＜0.01；與 MTX 組比較，**P＜ 0.01

組別 C5/C5a TIMP-1 M-CSF sICAM-1 Nor組1111 Con組0.560±0.6860.884±0.1070.529±0.7000.636±0.100 MTX組0.684±0.153△△1.234±0.266△△0.602±0.100△△0.652±0.100 MCL組0.709±0.115**△△0.943±0.173**△△0.598±0.231**△△0.450±0.073

圖2 細(xì)胞因子檢測結(jié)果

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種全身性慢性侵蝕性關(guān)節(jié)炎為特征的自身免疫病[12]，病變特點(diǎn)為滑膜炎，以及由此造成的關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形。該病分布于世界各地，未經(jīng)正規(guī)治療，約75%的患者會在3年之內(nèi)致殘。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療方法有理療、藥物治療、外科手術(shù)等。其中藥物治療又包含非甾體抗炎藥、慢性抗風(fēng)濕藥、促腎上腺皮質(zhì)激素、生物制劑和中草藥等多種藥物，然而目前為止，還沒有哪種藥物不但可以很好的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎而且還具有很小的毒副作用[13]。

MCL是新近研究出的小分子化合物。在此次實驗中，筆者通過建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎DBA/1小鼠模型，探究了MCL對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用。通過對四組小鼠的體重檢測、關(guān)節(jié)炎評價、病理切片觀察以及血清內(nèi)細(xì)胞因子檢測，得知在整個實驗過程中，小鼠的體重并未受到藥物治療的影響，表明MCL沒有干擾小鼠的正常生活狀態(tài)。關(guān)節(jié)炎評價中足掌厚度結(jié)果、關(guān)節(jié)炎評分結(jié)果均與病理切片評分結(jié)果一致，均顯示為MCL組小鼠整體得分低于Con組，處于MTX組和Con組之間，此結(jié)果證明MCL在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎方面確實有一定的療效。在小鼠血清細(xì)胞因子檢測結(jié)果中，C5/C5a在 Nor組中表達(dá)量最高，MTX組次之，MCL組接近與MTX組，而C5/C5a是機(jī)體免疫應(yīng)答的一部分在適應(yīng)性免疫中有一定的作用[14]，提示MCL同MTX一樣均具有幫助機(jī)體恢復(fù)免疫調(diào)節(jié)功能的作用。TIMP-1為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類降解細(xì)胞外基質(zhì)的一類多肽家族，其高表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞遷移和增殖[15-16]。在此實驗中，MCL組和MTX組中TIMP-1的表達(dá)水平與Nor組幾乎一致，提示含笑內(nèi)酯有效的抑制了相應(yīng)細(xì)胞的遷移和增殖，對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎起到了一定的治療作用。M-CSF為巨噬細(xì)胞集落刺激因子，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的直接參與破骨細(xì)胞分化的兩種細(xì)胞因子之一。破骨細(xì)胞是骨細(xì)胞的一種，分解骨組織，行使骨吸收的功能，與成骨細(xì)胞在功能上相對應(yīng)，二者協(xié)同，在骨骼發(fā)育和形成過程中發(fā)揮著重要的作用[17-18]。此實驗中，MCL組的M-CSF水平與略高于Con組，MTX組接近與Nor組且均較前兩組高，表明MTX都能夠在一定程度上恢復(fù)M-CSF的表達(dá)情況，從而在一定程度上恢復(fù)骨組織的自我調(diào)節(jié)能力，而MCL的療效略低于MTX。MCL組中sICAM-1的表達(dá)水平低于其他各組，表明MCL對一些細(xì)胞的穩(wěn)定調(diào)節(jié)能力不是很強(qiáng)，MCL組出現(xiàn)了BLC的表達(dá)，說明MCL具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能。

綜上所述，MCL具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，能夠在一定程度上幫助機(jī)體恢復(fù)免疫調(diào)節(jié)功能。C5/C5a，TIMP-1等細(xì)胞因子可能在MCL對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的調(diào)節(jié)中起到一定的作用。

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