李華+徐佳+劉海燕

摘 要 目的：以環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CPA）和他莫昔芬（tamoxifen，TMX）為模型藥物，建立人肝微粒體-小鼠3T3成纖維細(xì)胞模型，并用該模型評(píng)價(jià)5-羥基雷公藤內(nèi)酯醇（T8）代謝產(chǎn)物的細(xì)胞毒性。方法：采用人肝微粒體（加或不加NADPH）-小鼠3T3成纖維細(xì)胞模型，測(cè)定吸光度（A值）并計(jì)算細(xì)胞孵育液的EC50值和EC50 shift，以EC50 shift評(píng)價(jià)代謝產(chǎn)物毒性。結(jié)果：模型藥物CPA和TMX及創(chuàng)新藥物T8的EC50 shift分別為0.34、>4.7和1.2，表明CPA和TMX的代謝物會(huì)分別增加和降低細(xì)胞毒性，而T8代謝產(chǎn)物不影響或稍許降低對(duì)細(xì)胞的毒性。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功建立人肝微粒體-小鼠3T3成纖維細(xì)胞模型，這為T8進(jìn)入體內(nèi)的安全性提供了一定依據(jù)，也為候選化合物開(kāi)發(fā)初期在不合成代謝物的情況下初步評(píng)價(jià)代謝物的細(xì)胞毒性提供了一種體外方法。

關(guān)鍵詞 人肝微粒體 3T3成纖維細(xì)胞 細(xì)胞毒性 環(huán)磷酰胺 他莫昔芬 5-羥基雷公藤內(nèi)酯醇

中圖分類號(hào)：R992； R965.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2014）19-0074-05

Evaluation of the cytotoxicity of 5-hydroxytriptolide metabolites

with human liver microsome and mouse 3T3 fibroblast experimental system

LI Hua， XU Jia， LIU Haiyan*

（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To evaluate the cytotoxicity of 5-hydroxytriptolide （T8） metabolites by establishing human liver microsome （HLM） and mouse 3T3 fibroblast experimental system with cyclophosphamide （CPA） and tamoxifen （TMX） as model toxicants. Methods： Absorbance （A value） was determined based on HLM incubation systems （with or without NADPH） and the 3T3 fibroblast experimental system and the EC50 value and EC50 shift were calculated. The cytotoxicity of metabolites was evaluated by EC50 shift. Results： The EC50 shift for model toxicant CPA and TMX and novel compound T8 were 0.34， >4.7 and 1.2， respectively， which demonstrated that the cytotoxicity could be increased or reduced by the metabolites of CPA and TMX， respectively while could not be affected or slightly reduced by the metabolites of T8. Conclusion： A human liver microsome and mouse 3T3 fibroblast experimental system was successfully established， which can provide a certain basis for the safety of T8 in human body as well as an in vitro method for the preliminary evaluation of the cytotoxicity of metabolites without synthesis of possible metabolites in the early development phase of drug candidates.

KEY WORDS human liver microsome； 3T3 fibroblast cell； cytotoxicity； cyclophosphamide； tamoxifen； 5-hydroxytriptolide

在化合物篩選過(guò)程中，盡早評(píng)價(jià)化合物進(jìn)入體內(nèi)后可能產(chǎn)生的毒性，有助于盡快發(fā)現(xiàn)候選化合物。與在動(dòng)物體內(nèi)評(píng)價(jià)化合物毒性的實(shí)驗(yàn)方法相比，體外實(shí)驗(yàn)所需化合物量相對(duì)較少，通量較高，更便于化合物初期篩選?；衔镞M(jìn)入體內(nèi)后主要通過(guò)肝臟代謝產(chǎn)生代謝物，而肝臟代謝對(duì)化合物毒性的影響主要有兩種方式：①相對(duì)沒(méi)有毒性的化合物通過(guò)肝臟代謝產(chǎn)生毒性代謝物，毒性代謝物通過(guò)體循環(huán)進(jìn)入其他器官而產(chǎn)生細(xì)胞毒性，稱為“代謝增毒”，如藥物環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CPA）[1-4]，作為臨床常用的烷化劑類免疫抑制劑，可用于治療各種自身免疫性疾病。CPA進(jìn)入體內(nèi)經(jīng)CYP2B6代謝產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用的代謝物，然而代謝物也會(huì)通過(guò)體循環(huán)進(jìn)入其他組織產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。②藥物本身具有細(xì)胞毒性，通過(guò)肝臟代謝產(chǎn)生相對(duì)沒(méi)有毒性的代謝物，稱為“代謝減毒”，如藥物他莫昔芬（tamoxifen，TMX）[5-8]，作為一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑用于治療乳腺癌和卵巢癌，可直接對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，TMX經(jīng)CYP2D6和CYP3A4代謝產(chǎn)生無(wú)細(xì)胞毒性的活性代謝物。

（5R）-5-羥基雷公藤內(nèi)酯醇（簡(jiǎn)稱T8）是由上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司中央研究院開(kāi)發(fā)的用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一類創(chuàng)新藥物[9]，目前已完成I期臨床試驗(yàn)，正籌備開(kāi)展II期臨床試驗(yàn)。T8人體擬用藥劑量低（≤1 mg），進(jìn)入人體后主要通過(guò)I相代謝消除，產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，包括多個(gè)脫氫和單氧化代謝產(chǎn)物，因此較難通過(guò)合成代謝物的方式評(píng)價(jià)代謝產(chǎn)物毒性。本文通過(guò)所建立的方法研究T8代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒性，以期為T8進(jìn)入體內(nèi)的安全性評(píng)價(jià)提供一定依據(jù)。

材料與方法

材料

藥品與試劑

人肝微粒體、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）購(gòu)自美國(guó)BD公司；Balb/c 小鼠3T3成纖維細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所；高糖DMEM培養(yǎng)基、谷氨酰胺、雙抗（添加青霉素10 000 U·L-1， 鏈霉素10 000 mg·L-1）、小牛血清（NHCS）、Hank緩沖液、0.25%胰蛋白酶-EDTA、十二烷基硫酸鈉（SDS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；CPA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TMX為USP標(biāo)準(zhǔn)品；T8（圖1）由上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司中央研究院合成室提供；乙腈購(gòu)自德國(guó)Merck公司；試驗(yàn)用水為滅菌去離子水。

耗材

96孔培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）；0.22 mm無(wú)菌針頭過(guò)濾器（德國(guó)Merck Millipore公司）；2 ml一次性使用無(wú)菌注射器（上海米沙瓦醫(yī)科工業(yè)有限公司）。

試驗(yàn)儀器

Logic A2生物安全柜（美國(guó)Labconco公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱、恒溫孵育器、CBS-47液氮罐和Varioskan Flash酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；TS100 型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；3K15離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；ZHWY-103B多振幅軌道式恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

方法

溶液配制

CPA作為“代謝增毒”的模型藥物，用乙腈配制濃度為6 mol·L-1的儲(chǔ)備液及系列工作溶液：0，0.05，0.15，0.3，0.5，0.6，1，1.5，3，6 mol·L-1。TMX作為“代謝解毒”的模型藥物，用乙腈配制濃度為120 mmol·L-1的儲(chǔ)備液及系列工作溶液：0，0.3，0.6，1.5，2.5，6，10，20，40，120 mmol·L-1。待測(cè)物T8用乙腈配制濃度為500 mmol·L-1的儲(chǔ)備液及系列工作溶液：0，0.1，1，5，10，20，50，100，250，500 mmol·L-1。

人肝微粒體孵育

人肝微粒體孵育體系分為兩種：①加入輔酶NADPH發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生代謝物；②不加輔酶NADPH。用高糖DMEM培養(yǎng)基將人肝微粒體稀釋到1.25 mg·ml-1，NADPH稀釋到10 mmol·L-1，現(xiàn)用現(xiàn)配。最終反應(yīng)體積為200 ml，人肝微粒體最終作用濃度為1 mg·ml-1，NADPH為1 mmol·L-1，化合物工作液加入2 ml。37 ℃孵育3 h，每一作用濃度3樣本，深孔板離心（6 000 g，15 min）后每樣本取175 ml上清，3樣本合并。孵育液經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，用細(xì)胞培養(yǎng)液等體積（1∶1）稀釋后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)

將3T3細(xì)胞接種于T-75組織培養(yǎng)曲頸瓶中，置37 ℃含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)60%以上時(shí)，進(jìn)行傳代。將原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基倒出，加入 0.05%胰蛋白酶-EDTA消化，蓋過(guò)瓶底，37 ℃下消化至顯微鏡下觀察細(xì)胞呈圓形，漸漸浮起。加10% NBCS-DMEM終止消化，用吸管吹打混勻，沖洗壁上細(xì)胞，直至顯微鏡下觀察細(xì)胞已全部浮起，離心去上清，沉淀制成6×104細(xì)胞ml-1的懸液，按100 ml/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，20～24 h后加入給藥溶液100 ml/孔，孵育48 h后進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)。評(píng)價(jià)3T3細(xì)胞活性采用SDS [10]，用培養(yǎng)液配制成SDS濃度為10 mg·ml-1的儲(chǔ)備液和工作液：10，20，30，40，50，60，75，100 mg·ml-1，如上述方法進(jìn)行細(xì)胞給藥。

CCK-8實(shí)驗(yàn)

吸棄給藥溶液，加入含10%（v/v）CCK-8 的Hank緩沖液（100 ml/孔），溫孵適當(dāng)時(shí)間后用酶標(biāo)儀于450 nm測(cè)定吸光度（A值）。

EC50 shift計(jì)算和數(shù)據(jù)處理

細(xì)胞活率按下式計(jì)算：

（1）

（1）中?值為每個(gè)濃度下平行3孔A值的平均值，空白對(duì)照組為不含藥物的細(xì)胞孵育液；實(shí)驗(yàn)組為不同藥物、不同濃度下的細(xì)胞孵育液。

EC50 shift = EC50（+NADPH）/EC50（-NADPH） （2）

（2）中EC50為3T3細(xì)胞活率被抑制50%時(shí)的作用藥物濃度；EC50（+NADPH）為加入NADPH的人肝微粒體孵育液對(duì)3T3細(xì)胞活率抑制50%時(shí)的作用藥物濃度；EC50（-NADPH）為不加NADPH的人肝微粒體孵育液對(duì)3T3細(xì)胞活率抑制50%時(shí)的作用藥物濃度，本方法初步設(shè)定按以下方式判斷代謝物細(xì)胞毒性：①EC50 shift≥2，產(chǎn)生的代謝物會(huì)減少細(xì)胞毒性；②1≤EC50 shift<2，產(chǎn)生的代謝物不影響或會(huì)稍許減少細(xì)胞毒性；③EC50 shift≤0.5，產(chǎn)生的代謝物會(huì)增加細(xì)胞毒性；④0.5

統(tǒng)計(jì)分析

用Origin 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件作圖并計(jì)算EC50。

試驗(yàn)結(jié)果

3T3細(xì)胞活性評(píng)價(jià)

不同濃度SDS對(duì)3T3-CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。計(jì)算得到SDS的EC50為49.1 mg·ml-1，與文獻(xiàn)結(jié)果一致[10]，表明3T3細(xì)胞活性正常，可用于評(píng)價(jià)化合物細(xì)胞毒性。

“代謝增毒”模型藥物CPA

不同濃度CPA對(duì)3T3-CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。計(jì)算得到EC50（+NADPH）約為3.35 mmol·L-1，EC50（-NADPH）約為9.89 mmol·L-1，EC50 shift約為0.34，表明CPA代謝物會(huì)增加細(xì)胞毒性。這與CPA進(jìn)入人體后通過(guò)CYP2B6代謝產(chǎn)生有細(xì)胞毒作用代謝物的結(jié)果一致。

“代謝減毒”模型藥物TMX

不同濃度TMX對(duì)3T3-CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。計(jì)算得到EC50（+NADPH）大于600 mmol·L-1，EC50（-NADPH）約為127 mmol·L-1，EC50 shift大于4.7，表明TMX代謝物會(huì)降低細(xì)胞毒性。這與TMX可直接對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，通過(guò)CYP2D6和CYP3A4代謝產(chǎn)生相對(duì)無(wú)毒性活性代謝物的結(jié)果一致。

T8代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒性評(píng)價(jià)

不同濃度T8對(duì)3T3-CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。計(jì)算得到EC50（+NADPH）約為0.801 mmol·L-1，EC50（-NADPH）約為0.692 mmol·L-1，EC50 shift約為1.2，表明母藥T8對(duì)細(xì)胞有毒性，T8的代謝產(chǎn)物不影響或稍許降低對(duì)細(xì)胞的毒性作用。

討論

化合物開(kāi)發(fā)初期若通過(guò)合成代謝物的方法考察代謝產(chǎn)物細(xì)胞毒性既費(fèi)時(shí)且成本又高。目前有文獻(xiàn)報(bào)道[11～13]采用凍存肝細(xì)胞和不具有代謝功能的小鼠3T3細(xì)胞共孵育方法研究代謝物對(duì)細(xì)胞的毒性，Li等[13]以CPA和TMX分別作為“代謝增毒”和“代謝解毒”的模型藥物，但采用的人肝細(xì)胞和共孵育膠原包被IdMOC-96孔板價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)通量較低，對(duì)初期篩選而言成本很高。本實(shí)驗(yàn)采用可以發(fā)生I相代謝但價(jià)格相對(duì)實(shí)惠的人肝微粒體代替凍存人肝細(xì)胞孵育代謝物，同樣以CPA和TMX作為模型藥物建立了方法，并通過(guò)3T3細(xì)胞EC50 shift評(píng)價(jià)代謝物毒性，該模型成功驗(yàn)證了CPA代謝物可增加細(xì)胞毒性，TMX代謝物可降低細(xì)胞毒性。

T8是由我院開(kāi)發(fā)的用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一類創(chuàng)新候選藥物，目前已完成I期臨床試驗(yàn)，正籌備開(kāi)展II期臨床試驗(yàn)。研究表明T8進(jìn)入人體后主要通過(guò)I相代謝消除，產(chǎn)生多種代謝物，包括單氧化、環(huán)氧開(kāi)環(huán)形成二醇和脫氫等，但沒(méi)有相對(duì)比例較高的代謝物，很難通過(guò)合成代謝物的方式評(píng)價(jià)其代謝物毒性，本文建立的方法適于這種情況下的代謝物的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。T8在臨床II期擬用最高劑量為1 mg，臨床I期試驗(yàn)結(jié)果顯示，1 mg劑量連續(xù)給藥14 d后，T8的Cmax平均值為16.2 ng·ml-1，約為43 nmol·L-1。介于上述考慮，本次試驗(yàn)將T8的作用濃度范圍設(shè)為0.000 5～2.50 mmol·L-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示T8的EC50 shift約為1.2，這表明T8經(jīng)代謝之后產(chǎn)生的代謝物不改變或會(huì)稍許降低細(xì)胞毒性，這為T8進(jìn)入人體后的安全性提供了依據(jù)。

本方法采用人肝微粒體孵育代謝物主要針對(duì)由CYP450酶代謝的化合物，如果研究化合物主要通過(guò)II相代謝產(chǎn)生代謝物，就要在孵育體系上作相應(yīng)調(diào)整。另外，有些化合物的溶解度比較差，不能實(shí)現(xiàn)預(yù)設(shè)的最高作用濃度，在試驗(yàn)中要注意觀察并及時(shí)調(diào)整。本文建立的評(píng)價(jià)代謝物細(xì)胞毒性的體外實(shí)驗(yàn)方法成本低，通量高，易操作，有利于初期篩選，并為候選化合物在不合成代謝物的情況下評(píng)價(jià)代謝物毒性提供了參考方法。

參考文獻(xiàn)

Chang TK， Weber GF， Crespi CL， et al. Differential activation of cyclophosphamide and ifosphamide by cytochromes P-450 2B and 3A inhuman liver microsomes[J]. Cancer Res， 1993， 53（23） ： 5629-5637.

McErlane V， YakkundiA， McCarthy HO， et al. A cytochrome P450 2B6 meditated gene therapy strategy to enhance the effects of radiation or cyclophosphamide when combined with the bioreductive drug AQ4N[J]. J Gene Med， 2005， 7（7）： 851-859.

Bacon AM， Rosenberg SA. Cyclophosphamide hepatotoxicity in a patient with systemic lupus erythematosus[J]. Ann Intern Med， 1982， 97（1）： 62-63.

Singh G， Saxena N， Aggarwal A， et al. Cytochrome P450 polymorphism asa predictor of ovarian toxicity to pulse cyclophosphamide in systemic lupuserythematosus[J]. J Rheumatol， 2007， 34（4）： 731-733.

Al-Akoum M， Dodin S， Akoum A. Synergistic cytotoxic effects of tamoxifen and black cohosh on MCF-7 and MDA-MB-231 human breast cancer cells： an in vitro study[J]. Can J Physiol Pharmacol， 2007， 85（11）： 1153-1159.

Cruz Silva MM， Madeira VM， Almeida LM， et al. Hemolysis of human erythrocytes induced by tamoxifen is related to disruption of membrane structure[J]. Biochim Biophys Acta， 2000， 1464（1）： 49-61.

Petinari L， KohnL K， de Carvalho JE， et al. Cytotoxicity of tamoxifen in normal and tumoral cell lines and its ability to induce cellular transformation in vitro[J]. Cell Biol Int， 2004， 28（7）： 531-539.

Kasahara T， Hashiba M， Harada T， et al. Change in the gene expression of hepatic tamoxifen-metabolizing enzymes during the process of tamoxifen-induced hepatocarcinogenesis in female rats[J]. Carcinogenesis， 2002， 23（3）： 491-498.

徐佳， 向志雄， 劉海燕. 5-羥基雷公藤內(nèi)酯醇不是P-糖蛋白底物或抑制劑[J]. 上海醫(yī)藥， 2013， 34（13）： 56-61.

Yang XF， Zhang WG， Yang Y， et al. Preliminary study on neutral red uptake assay as an alternative method for eye irritation test[C]. Tokyo： Proc. 6th World Congress on Alternatives & Animal Use in the Life Sciences， 2007： 509-514.

Bhatia SN， Yarmush ML， Toner M. Controlling cell interactions by micropatterning in co-cultures： hepatocytes and 3T3 fibroblasts[J]. J Biomed Mater Res， 1997， 34（2）： 189-199.

Toussaint MJ， Nederbragt H. Lack of effect of extracellular matrix or 3T3 feeder layer on the maintenance of differentiation or survival time of cultured rat hepatocytes[J]. Toxicol In Vitro， 1995， 9（1）： 83-90.

Li AP， Uzgare A， LaForge YS. Definition of metabolism-dependent xenobiotic toxicity with co-cultures of human hepatocytes and mouse 3T3 fibroblasts in the novel integrated discrete multiple organ co-culture （IdMOC） experimental system： results with model toxicants aflatoxin B1， cyclophosphamide and tamoxifen[J]. Chem Biol Interact， 2012， 199（1）：1-8.

（收稿日期：2013-12-03）