張迪 劉長虹 章錦才 蔡德鴻 楊曉喻 李世軼 鐘惠蘭

1.南方醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院·廣東省口腔醫(yī)院種植科，廣州 510280；2.南方醫(yī)科大學附屬珠江醫(yī)院內分泌科，廣州 510282

隨著社會經濟的發(fā)展以及口腔修復意識的進步，現(xiàn)在越來越多的患者選擇種植修復缺失牙，而骨量不足患者的種植修復因風險大而成為學者們研究的重點。種植體表面處理的目的是為了促進成骨細胞在種植體表面更好地成骨[1]。目前國內外學者著力于研究種植體的不同表面處理方法，如小分子靶向肽修飾殼聚糖作為基因載體、金屬鈦表面接枝短肽促進成骨細胞的附著與成骨[2]等。

RGD肽是一類含有精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）序列的短肽，廣泛存在于生物體內，可與11種整合素特異性結合，促進成骨細胞生長，抑制破骨細胞之間及破骨細胞與基質之間的黏附，從而促進骨組織再生[3]。將RGD肽組裝到種植體表面，能明顯促進種植體周圍的新骨形成，增加種植體固位力。種植體表面RGD組裝方法對其在種植體表面上的應用以及種植體骨整合均有一定的影響。改善RGD肽在種植體表面的固定方法是近年來學者們研究的熱點[4]。

殼聚糖（chitosan，CS）是一種新型的非病毒基因載體材料，與機體的生物相容性好，可生物降解，能有效地濃縮質粒DNA（plasmid DNA，pDNA），同時其表面帶有的陽離子還可以和帶有陰離子的DNA有效地結合，從而保護DNA免受DNA酶（DNaseⅠ）的降解[5]。此外，CS具有強的生物黏附作用，毒副作用小，來源豐富，價格低廉，作為非病毒性基因載體具有獨特的優(yōu)勢。但是，殼聚糖的低靶向性和低轉染效率限制了其臨床應用[6]。為了提高殼聚糖的靶向性以及轉染效率，本研究擬在殼聚糖分子上進行短肽修飾，然后包裹pDNA，形成RGDCS/pDNA復合體，通過鈦表面層層自組裝以及化學偶聯(lián)的方法將復合體接枝到種植體表面，以達到提高種植體植入后成骨效率的目的。

1 材料和方法

1.1 主要材料和設備

CS（分子質量5.0×104，脫乙酰度大于等于90%，浙江金殼生物化學有限公司），1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽[1-(3-Dimethylamino propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC·HCl]（上海共價化學科技有限公司），N-羥基琥珀酰亞胺（N-Hydroxysuccinimide，NHS）（上海延長生化科技發(fā)展有限公司），RGD肽（無錫亞肽生物科技有限公司），pDNA（華南農業(yè)大學資源環(huán)境學院），瓊脂糖（上海賽百盛基因技術有限公司），上樣緩沖液（loading buffer）（TaKaRa公司，日本），DNaseⅠ（TaKaRa公司，日本），純鈦板（ 寶雞三線有色金屬材料廠）。

FT-IT Nicolet Impact 410型紅外光譜儀（Nicolet公司，美國），Elementar Vario EL Ⅲ元素分析測定儀（Elementar公司，德國），BG-power 600電泳儀（北京百晶生物技術有限公司），GelDoc IT TS2凝膠成像分析系統(tǒng)（UVP公司，美國），NanoacopeⅢ原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）（Veeco公司，美國），透析袋（MWCO 3500，上海綠鳥科技發(fā)展有限公司）。

1.2 鈦表面物理、生化處理[7]

將商業(yè)純鈦片切割成方形試樣，表面噴砂粗化后行燒結處理，然后進行混合酸液（98%H2SO4︰30%H2O2為1︰1）酸洗2 min，丙酮、無水乙醇、雙蒸水依次超聲清洗15 min，干燥。80 ℃、5 mo l·L-1NaOH溶液羥化處理24 h，80 ℃雙蒸水陳化24 h，雙蒸水沖洗，干燥。鈦酸四正丁酯（C16H36TiO4）與異丙醇1︰3混合，劇烈攪拌（60 ℃，4 h），制備納米級TiO2溶膠。羥化后純鈦浸潤于溶膠反應10 min，無水乙醇超聲清洗，雙蒸水再羥化1 min，干燥。重復3次。反應如圖1。

圖1 純鈦表面接枝RGD-CS/pDNA復合體示意圖Fig 1 The illustration of grafting RGD-CS/pDNA of titanium surface

1.3 RGD接枝CS形成RGD-CS[8]

1.3.1 ?；磻悸?lián)RGD與CS形成RGD-CS 稱取RGD肽20.0 mg，用1%HAc-NaAc緩沖液（pH 6.0）2 mL溶解。加入EDC·HCl 100 mg，NHS 50 mg，在4 ℃下磁力攪拌，活化12 h。稱取相對分子質量為50×103的CS 20 mg溶于適量1%HAc溶液中，攪拌溶解。用1%NaOH溶液調節(jié)pH至6.0，得到黃色澄清溶液。在攪拌下，緩慢滴入活化的RGD溶液中。4 ℃下繼續(xù)攪拌24 h。將反應液轉移至透析袋中，用去離子水透析3 d，每12 h更換一次透析液。透析完畢后，產物凍干待用。反應如圖1。

1.3.2 RGD-CS化學結構的表征檢測 采用紅外光譜儀對RGD-CS進行紅外光譜檢測（KBr壓片法），元素分析儀對CS、RGD、RGD-CS 3種樣品中元素C、H、N的含量進行測定。

1.4 RGD-CS包裝pDNA

1.4.1 復凝聚法制備RGD-CS/pDNA復合體 稱取RGD-CS 10.0 mg，溶于0.2 mol·L-1HAc-NaAc緩沖液（pH 5.0）10 mL中，配制成質量濃度為1 mg·mL-1的RGD-CS溶液。將pDNA配制成0.1 mg·mL-1的溶液。在每一部分實驗中，保持每個樣品中加入的DNA的質量一定，按照不同的N/P（陽離子載體中的氮原子與DNA的磷原子的摩爾比例）加入一定量的RGD-CS溶液，N/P為0、1、2、5、10、20、50。采用0.2 mol·L-1HAc-NaAc緩沖液（pH 5.0）將復合體溶液定容至相同體積。分別取RGD-CS溶液與骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）2質粒溶液在55 ℃水浴預熱10 min，迅速將二者混合，通過渦旋儀混勻1 min，將混合物在室溫下放置30 min，即得RGD-CS/pDNA復合體。反應如圖1。以不經RGD修飾的CS作為對照，在同樣條件下，合成CS/pDNA復合體。

1.4.2 凝膠電泳阻滯試驗檢測RGD-CS對質粒的包裹情況 選取不同N/P比制備樣品，取16 μL RGD-CS/BMP2復合體與4 μL Loading Buffer混合，在120 mV電壓下電泳30 min。紫外燈下觀察RGD-CS對質粒的包裹情況。

1.4.3 AFM觀察RGD-CS/pDNA復合體 取RGD-CS/pDNA復合體固定于云母片上，在輕敲模式下用AFM觀察其形態(tài)，輕敲頻率37 kHz，掃描速度1.00 Hz，掃描范圍5 μm×5 μm（粗略掃描）或2 μm×2 μm（精細掃描）。

1.5 RGD-CS/pDNA復合體接枝鈦片

1.5.1 RGD-CS/pDNA復合體接枝鈦片的制備 將鈦酸四正丁酯（C16H36TiO4）與異丙醇以1︰3的體積比混合，劇烈攪拌（60 ℃，4 h），制備納米級TiO2溶膠。羥化后純鈦浸潤于溶膠，反應10 min，無水乙醇超聲清洗，雙蒸水再羥化1 min，干燥。重復上述過程3次。配置7%的3-氨基-三甲氧基硅烷/正己烷自組裝液，溶膠涂層后，鈦試樣置于密閉容器中與自組裝液反應，室溫24 h，正己烷溶劑超聲清洗15 min。將RGD-CS/pDNA復合體按5 mg·mL-1溶于0.1 mol·L-12-嗎啉乙磺酸[2-(4-Morpholino)ethanesulfonic acid，MES]/0.5 mol·L-1NaCl活化緩沖液中，調節(jié)pH 6.0，使復合體濃度為1.5 mmol·L-1。加入交聯(lián)劑EDC·HCl（0.4 mg·mL-1）和NHS（0.6 mg·mL-1）反應15 min，調節(jié)pH 7.0。將氨基化純鈦浸潤在RGD-CS/pDNA復合體混合液中，室溫避光振蕩反應隔夜。30 mmol·L-1Tris液中止反應。去離子水徹底清洗鈦試樣3次，每次5 min，去除表面多余物理吸附的復合體，超凈臺風干備用。

1.5.2 EB染色法紫外燈下檢測鈦片表面RGD-CS/pDNA復合體的接枝效果 用移液器在鈦片表面滴加0.2 pg·mL-1的EB染料，室溫條件下染色10 min，在紫外凝膠成像儀下拍照；以白光下接枝有RGDCS/pDNA復合體鈦片以及紫外燈下未接枝RGD-CS/pDNA復合體的鈦片為對照。

2 結果

2.1 CS接枝RGD

紅外光譜檢測表明，在偶聯(lián)了RGD肽后，RGDCS在1 630 cm-1附近的酰胺Ⅰ帶顯著增加（圖2），這表明：在偶聯(lián)的過程中生成了更多的碳氧雙鍵，證實了酰胺化的成功。

圖2 紅外光譜分析Fig 2 IR spectrum of CS and RGD-CS

元素分析表明，在偶聯(lián)了RGD肽后，RGD-CS的N原子含量比例明顯高于單純的CS（表1），這進一步表明：CS接枝RGD成功。

表1 CS/RGD/RGD-CS的元素分析結果Tab 1 Element analysis of CS/RGD/ RGD-CS %

2.2 RGD-CS包裝pDNA

凝膠電泳阻滯試驗表明：N/P≥2時，pDNA質?？赏耆籖GD-CS包裹（圖3），表明RGD-CS與pDNA完全復合。原子力顯微鏡下可以清晰地看到，N/P=2時RGD-CS/pDNA復合體呈類球形（圖4）。

2.3 RGD-CS/pDNA復合體接枝鈦片

在紫外燈下可見鈦片表面具有DNA的熒光（圖5），表明鈦表面接枝RGD-CS/pDNA復合體成功。

圖3 不同N/P下，RGD CS對pDNA包裹的電泳圖Fig 3 Electrophoregram of RGD-CS with pDNA under different N/P

圖4 原子力顯微鏡下的RGD-CS/pDNA復合體Fig 4 RGD-CS/pDNA complexes under atomic force microscope

圖5 RGD-CS/pDNA復合體接枝鈦片的表面觀察 EB染色Fig 5 Detect RGD-CS/pDNA complex of titanium EB staining

3 討論

種植體表面的特性很大程度上影響了細胞的黏附及隨后的細胞分化、基質分泌以及組織的愈合，因而與種植體的臨床成功率密切相關[9]。有學者[10]將人工合成的RGD序列固定于生物材料表面，結果發(fā)現(xiàn)可以促進細胞對生物材料的黏附。將生物活性短肽RGD序列固定在種植體表面，以促進成骨細胞對純鈦或鈦合金等生物材料的黏附，促進種植體骨整合，提高種植義齒的成功率，是近幾年種植體表面處理研究的重要進展[11]。本研究的重點在于設計合成經RGD修飾的基因治療載體，接枝在純鈦表面，以增加后期實驗中種植體與骨的整合，進一步改善RGD 序列在種植體表面的固定方法以及RGD序列在種植體表面處理中的臨床應用。

RGD與材料表面穩(wěn)定的連接是促進細胞黏附的關鍵因素，金屬鈦表面缺乏可以供RGD結合的功能基團，因此需要應用生化、物理等方法處理金屬鈦表面，使其具有氨基、羥基或羧基等功能基團，從而能以共價鍵的形式與RGD相連[12]。本研究中采用純鈦片模擬在臨床上使用的種植體表面處理方式，成功在殼聚糖上接枝RGD肽，并包裹BMP2質粒形成RGD-CS/pDNA復合體，之后，將復合體成功接枝在金屬鈦片表面，開創(chuàng)了全新的種植體表面處理技術。本實驗用過氧化氫處理鈦表面，使其產生功能羥基，利用EDC與NHS活化RGD，在NaOH在作用下，使RGD與CS接枝；在HAc-NaAc緩沖液條件下，使RGD-CS包裹質粒DNA形成RGD-CS/pDNA復合體；金屬鈦經NaOH、鈦酸正四丁酯修飾后，以共價鍵形式將RGD-CS/pDNA復合體接枝到表面。這是第一次將該方法應用于種植體軟組織接觸部位的改性處理。元素分析證明，CS、RGD與pDNA三者成功形成了RGD-CS/pDNA復合體，原子力顯微鏡檢測表明復合體顆粒呈類球形。RGD-CS/pDNA復合體接枝鈦片后，其表面經EB染色后，可在紫外燈下觀察到具有熒光，這表明鈦表面存在有DNA，說明RGD-CS/pDNA復合體接枝鈦片成功。

目前尚無有效的方法可以將目的基因導入貼附在種植體表面的細胞內并穩(wěn)定地表達。質粒轉化細胞實驗技術已經非常成熟，且無需對細胞或質粒進行特別處理，便能確保質粒高效轉化到細胞中[13]；但在種植體表面，組織與種植體直接接觸，如何使種植體表面攜帶的目標基因高效地轉化到組織內，并在組織與種植體之間形成新的骨形成蛋白，尚無突破性進展[14]。出于此目的，本實驗在結合以往技術優(yōu)勢的同時，創(chuàng)立了一種新的種植體表面修飾方法，為種植體臨床應用提供了理論依據(jù)。但在本實驗中，質粒已預先固定在鈦表面，而后期實驗細胞游離在培養(yǎng)基中，這與臨床上種植體鑲嵌于人體組織內的情況不同，后續(xù)的研究將進一步通過細胞和動物實驗驗證其生物安全性以及臨床實用性，為種植體表面處理技術實現(xiàn)突破性的變革。

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