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        茄子SSR遺傳多樣性及其農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析

        2014-10-11 02:32:02馮英娜柳李旺劉衛(wèi)東崔群香
        江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報 2014年4期
        關(guān)鍵詞:茄子關(guān)聯(lián)遺傳

        馮英娜, 柳李旺, 劉衛(wèi)東, 王 倩, 崔群香

        (1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),江蘇 南京 210095;2.金陵科技學(xué)院,江蘇 南京 211169)

        茄子(Solanum melongenaL.)亦稱落酥、昆侖瓜,是茄科(Solanaceae)茄屬作物,染色體為2n=24,屬于漿果。茄子起源于東南亞熱帶地區(qū)。中國栽培茄子歷史悠久,品種繁多,是世界上最大的茄子生產(chǎn)國和消費國。茄子的營養(yǎng)價值很高,含有豐富的蛋白質(zhì)、糖、維生素和多種礦質(zhì)元素。另外茄子還含有豐富的維生素P,為蔬菜中最高。茄子藥效顯著,具有清熱、解毒、活血、止痛、利尿、消腫、降低膽固醇等功效[1]。

        SSR(Simple sequence repeats),又稱為微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA),是以聚合酶鏈式反應(yīng)PCR(Polymerase chain reaction)為基礎(chǔ)的標記。SSR標記是眾多分子標記技術(shù)中一種較好的方法,它具有共顯性、操作簡便、重復(fù)性好且廣泛分布于全基因組等優(yōu)點[2-8]。目前SSR廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、群體結(jié)構(gòu)分析、基因定位及關(guān)聯(lián)分析等多方面的相關(guān)研究[9-10],而在茄子上SSR標記發(fā)展相對滯后,目前僅見少量的被應(yīng)用于群體結(jié)構(gòu)分析和基因定位[11-12]。

        關(guān)聯(lián)分析是以自然群體為材料,能夠檢測群體內(nèi)處于連鎖不平衡狀態(tài)的標記或候選基因的遺傳變異與特定表型顯著關(guān)聯(lián)的頻率[13-14]。與連鎖分析方法相比,此方法具有三方面優(yōu)點:①花費時間少,一般以現(xiàn)有的自然群體為材料,無需構(gòu)建專門作圖群體;②可以同時檢測同一座位的多個等位基因;③作圖精度高。關(guān)聯(lián)分析的方法最早用在人類遺傳學(xué),用來挖掘人類的致病基因,應(yīng)用在植物上較晚。關(guān)聯(lián)分析方法目前主要用于小麥、水稻、棉花、大麥、大豆等經(jīng)濟作物[15-17]。在茄子方面還未見報道。本研究對全基因組進行掃描,目的在于初步了解茄子材料的連鎖不平衡現(xiàn)象,本試驗采用SSR標記對國內(nèi)外70個茄子材料進行遺傳多樣性分析、群體結(jié)構(gòu)分析和關(guān)聯(lián)分析,旨在為茄子的親本選擇提供依據(jù),同時通過分子標記與性狀關(guān)聯(lián)分析,進一步探討與形態(tài)和品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的分子標記位點,為茄子的分子育種提供理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        本試驗70份國內(nèi)外茄子材料,于2013年1月份在玻璃溫室進行育苗,2013年4月7日定植于金陵科技學(xué)院幕府校區(qū)園藝實驗站塑料大棚內(nèi),茄子田間形態(tài)調(diào)查參照李錫香等[18]方法。2013年5~6月份測定茄子的各個品質(zhì)指標。各材料及來源詳見表1。

        1.2 SSR引物分析

        本試驗選自的引物來自 Vilanova等[19]和 Zhu等[20]。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選出具有多態(tài)性的SSR引物54對,由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。2013年3月5日取新鮮植株的葉片,采用簡化CTAB法進行DNA提取。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。PCR總反應(yīng)體系為10.0μl,包括1 × Buffer 1.0 μl,Mg2+0.8 μl,dNTP 0.2 μl,TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)0.1 μl,正、反向引物各0.5 μl,ddH2O 5.9μl,DNA模板1.0μl。PCR程序為95℃ 2 min,94 ℃ 40 s,57 ℃ 45 s,72 ℃ 1min,32 個循環(huán);最后72℃延伸10min,4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳,銀染顯色拍照[21]。

        1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

        采用人工讀膠的方法,有帶的讀1,無帶的讀0,不確定的記為-9.以NTSYS-pc Ver.2.10計算遺傳相似系數(shù)(Genetic similarity,GS)并按非加權(quán)配對法(UPGMA)和SHAN程序聚類分析?;蝾l率和Shannon指數(shù)通過Popgene32進行統(tǒng)計分析。以Structure 2.3.4軟件[22]進行群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析,估計最佳群體組群數(shù)K,其取值范圍為1~10,將MCMC(Markov chain monte carlo)開始時的不作數(shù)迭代(Length of burn-in period)設(shè)為100 000次,再將不作數(shù)迭代后的MCMC設(shè)為100 000次,迭代次數(shù)(Number of iterations)設(shè)置為5,計算Q參數(shù),將其作為協(xié)變量。采用 TASSEL 2.0[23]中的 GLM(General linearmodel)模型結(jié)合分子標記數(shù)據(jù)、群體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和表型性狀數(shù)據(jù)進行標記-性狀的關(guān)聯(lián)分析,確定關(guān)聯(lián)位點[24]。

        2 結(jié)果

        2.1 分子標記多態(tài)性分析

        從供試材料中選擇6個表型差異大的材料對68對SSR引物進行篩選,從中選出擴增條帶清晰,重復(fù)性好,多態(tài)性豐富的SSR引物18對,共檢測到130個等位變異,平均每個引物7.2個等位變異,變化范圍2~9個等位變異。等位變異最多的標記為CSM44(圖1),共檢測到9個等位變異,其次是CSM40,檢測到7個等位變異?;蚨鄻有灾笖?shù)和Shannon指數(shù)變幅分別為0.070 0~0.404 4和0.103 6~0.584 8,平均值分別為0.181和0.263。大多數(shù)材料的遺傳相似系數(shù)分布在0.61至0.82之間,這表明不同茄子材料之間有一定差異,但差異不大,遺傳背景較窄。

        2.2 聚類分析

        利用18對SSR引物對茄子材料進行鑒定,對數(shù)據(jù)進行聚類分析,結(jié)果(圖2)顯示,在相似系數(shù)0.61處將70份材料分為6大類。第1類包含3個材料,果萼色都為綠色。第2類包含36個材料,在相似系數(shù)0.64處可進一步分為2個亞類,第1亞類主要是長茄,包括9份國內(nèi)長茄、2份荷蘭長茄、1份日本長茄、3份國內(nèi)圓茄和1份日本圓茄。第2亞類主要以紫茄為主,14份國內(nèi)紫茄、4份日本紫茄、2份國內(nèi)綠茄。第3類包括19份材料,在相似系數(shù)0.6處又可分為2個亞類,第1亞類只有45號果色為白色,其他均為紫色或者是紫黑。第2亞類均為紫色,主要以國內(nèi)茄為主,12份國內(nèi)茄、1份菲律賓茄、1份日本茄。第4類主要是長茄,果萼色均為綠紫。第5類為62號扁紅茄,來自于非洲,果色橘紅色,野生種。第6類是果萼色為綠紫,果色都是鮮紫。

        2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

        為了消除關(guān)聯(lián)分析時由于供試材料群體結(jié)構(gòu)引起的偽關(guān)聯(lián),根據(jù)Evanno等[25]的方法,利用18對引物對70個供試材料進行群體結(jié)構(gòu)檢測,結(jié)果顯示該群體可分為5個亞群,分別為POP1、POP2、POP3、POP4和POP5。根據(jù)每個亞類群中主要顏色所占的比例(Q值),將Q>0.6視為血緣單一,Q<0.6視為具有混合來源[26],分析不同基因型個體在相應(yīng)亞類群中的遺傳背景(圖3)。結(jié)果顯示,各亞類群間存在明顯的差異。POP1亞類群(紅色)包括16份材料,主要以紫色茄為主,各部分材料Q值均大于0.6,表明種質(zhì)來源單一,遺傳背景不復(fù)雜,同其他類群缺少基因交流。POP2亞類群(綠色)由29份材料組成,果萼色以綠紫為主,有8份材料Q值都在0.6以下,表明其具有混合來源,遺傳背景較復(fù)雜,如傾國69含有較多的POP1遺傳背景,主力長茄品種含有較多的POP5遺傳背景。萬壽龍品種含有較多的POP4、POP5遺傳背景。POP3亞類群(藍色),由15份材料構(gòu)成,以長筒茄為主。其中有8份材料遺傳背景復(fù)雜,按Q值從大到小依次為西方神茄、麗華、艷麗長、尼爾、扁紅茄、美引茄冠、蘇崎茄、紫塔號;從外形來看,果形、果萼色不同,基因交流較頻繁。POP4亞類群(黃色),由7份國內(nèi)長茄組成,其中4份材料來源于西南地區(qū),其混合來源單一。POP5亞類群(淺紫色),包括3份材料,果色為黑紫色。

        圖2 SSR標記的70份材料的UPGMA聚類圖Fig.2 Dendrogram of 70 eggplant varieties analyzed by SSR-UPGMA based on genetic similarities

        2.4 SSR標記與農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析

        本研究檢測的18對SSR引物,有13對引物的17個位點與測試性狀相關(guān)聯(lián)。結(jié)果(表2)顯示,其中與葉柄長相關(guān)聯(lián)的位點有5個,與單果質(zhì)量、可溶性蛋白質(zhì)、蘆丁、果色、果萼色5個性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點各3個,與株型、首花節(jié)位、可溶性糖3個性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點各有2個,其余的性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點只有1個。其中位點CSM44-1是關(guān)聯(lián)性狀最多的位點,與首花節(jié)位、果形、單果質(zhì)量、葉柄長4個性狀相關(guān)聯(lián),對4個性狀的變異解釋率分別為46.0%、50.1%、47.5%、42.3%。位點CSM33-5、CSM65-3是關(guān)聯(lián)性狀最少的位點,分別與株高、可溶性固形物關(guān)聯(lián),對其變異解釋率分別為21.1%、24.7%。位點CSM40-6、CSM47-2、CSM71-6分別與蘆丁、葉柄長、果萼色極顯著相關(guān)(P<0.01),其變異解釋率分別達到43.2%、29.8%、26.5%。

        分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),同一個位點與多個性狀相關(guān)聯(lián)和多個位點與同一性狀相關(guān)聯(lián)的情況很普遍。原因可能是蔬菜的許多重要的農(nóng)藝性狀均屬于由多個基因控制的數(shù)量性狀。

        3 討論

        3.1 茄子遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析

        分子標記是鑒定茄子材料親緣關(guān)系有效途徑之一。本研究用SSR對70份茄子材料遺傳多樣性分析,在一定程度上反應(yīng)了70份材料直接的親緣關(guān)系,聚類分析的遺傳相似系數(shù)大多數(shù)在0.56~0.93,平均相似系數(shù)在0.68,在分子水平上遺傳差異不大,這與前人的研究結(jié)果一致[12,27]。在茄子的育種過程中,育種工作者應(yīng)繼續(xù)努力拓寬茄子的遺傳基礎(chǔ),解決遺傳背景狹窄問題,為茄子品種選育提供豐富的親本。

        將群體結(jié)構(gòu)所得的Q值作為協(xié)變量代入回歸分析。以消除供試材料群體結(jié)構(gòu)的偽關(guān)聯(lián),確保關(guān)聯(lián)分析的準確性[28-29]。本研究基于SSR標記,利用Structure2.3.4軟件的群體結(jié)構(gòu)分析將70個材料分為5個亞類群。其中POP1亞類群主要是國內(nèi)茄,只有4份國外茄子材料,可能是頻繁的商業(yè)化導(dǎo)致基因之間的交流。表明茄子群體結(jié)構(gòu)的劃分與來源有一定的關(guān)系。這和肖熙歐等[30]、孫源文等[31]的研究比較吻合。POP2亞類群主要是紫茄(紫黑、鮮紫、紫紅)。扁圓茄、圓球茄、高圓茄分布在POP1、POP2、POP3、POP5亞類群中,可能是沒有篩選到合適的引物將他們分在一起。長條茄、長羊角茄、長筒茄主要分布在POP1、POP2、POP3 3個亞類群,這與傳統(tǒng)的Bailey[32]茄子分類相符。本試驗部分材料是國外引進的品種,但和中國的材料遺傳系數(shù)較高,可能是育種工作者的育種目標相同,導(dǎo)致遺傳背景相似。其次利用SSR標記進行群體結(jié)構(gòu)分析,必須要有足夠的多態(tài)性位點能覆蓋較全的基因組,才能提高群體結(jié)構(gòu)的準確性,但同其他標記相比,SSR引物產(chǎn)生的多態(tài)性較低,且研究中所使用SSR數(shù)目有限,使得結(jié)果可能產(chǎn)生誤差。

        表2 與農(nóng)藝相關(guān)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SSR位點Table 2 SSR loci significantly associated with agronom ic traits in eggplant

        3.2 茄子SSR分子標記的關(guān)聯(lián)分析

        關(guān)聯(lián)分析(Association analysis),又稱關(guān)聯(lián)作圖(Association mapping),首次將關(guān)聯(lián)分析用于植物上的是Hansen等[33]對野生甜菜生長習(xí)性的研究。其發(fā)現(xiàn)在17個引物組合擴增的440個全基因組范圍內(nèi)的AFLP引物中,有2個位點與控制抽薹前是否需要春化的B基因顯著關(guān)聯(lián)。目前關(guān)聯(lián)分析在作物方面主要用在小麥、玉米、水稻、棉花等。印志同等[34]采用71對SSR引物掃描85份糯玉米自交系材料進行耐鹽性鑒定,共檢測到9個標記位點分別與5個耐鹽性狀顯著關(guān)聯(lián),其中1個位點同時與2個性狀存在顯著關(guān)聯(lián)。王艷平等[35]用45份材料構(gòu)成的品種群體對38個特異性、一致性、穩(wěn)定性(DUS)測試性狀與45個分子標記進行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果表明,20個分子標記位點與23個DUS測試性狀相關(guān)聯(lián)。本研究在18對引物上共檢測13對引物的17個位點與茄子的14個數(shù)量性狀相關(guān)聯(lián)(P<0.05)。其中位點CSM21-4、CSM47-3、CSM63-5與果色顯著相關(guān),變異解釋率分別為28.4%、19.2%、26.7%。

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