馮英娜， 柳李旺， 劉衛(wèi)東， 王 倩， 崔群香

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210095;2.金陵科技學(xué)院，江蘇 南京 211169)

茄子(Solanum melongenaL.)亦稱落酥、昆侖瓜，是茄科(Solanaceae)茄屬作物，染色體為2n=24，屬于漿果。茄子起源于東南亞熱帶地區(qū)。中國栽培茄子歷史悠久，品種繁多，是世界上最大的茄子生產(chǎn)國和消費國。茄子的營養(yǎng)價值很高，含有豐富的蛋白質(zhì)、糖、維生素和多種礦質(zhì)元素。另外茄子還含有豐富的維生素P，為蔬菜中最高。茄子藥效顯著，具有清熱、解毒、活血、止痛、利尿、消腫、降低膽固醇等功效［1］。

SSR(Simple sequence repeats)，又稱為微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)，是以聚合酶鏈式反應(yīng)PCR(Polymerase chain reaction)為基礎(chǔ)的標記。SSR標記是眾多分子標記技術(shù)中一種較好的方法，它具有共顯性、操作簡便、重復(fù)性好且廣泛分布于全基因組等優(yōu)點［2-8］。目前SSR廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、群體結(jié)構(gòu)分析、基因定位及關(guān)聯(lián)分析等多方面的相關(guān)研究［9-10］，而在茄子上SSR標記發(fā)展相對滯后，目前僅見少量的被應(yīng)用于群體結(jié)構(gòu)分析和基因定位［11-12］。

關(guān)聯(lián)分析是以自然群體為材料，能夠檢測群體內(nèi)處于連鎖不平衡狀態(tài)的標記或候選基因的遺傳變異與特定表型顯著關(guān)聯(lián)的頻率［13-14］。與連鎖分析方法相比，此方法具有三方面優(yōu)點:①花費時間少，一般以現(xiàn)有的自然群體為材料，無需構(gòu)建專門作圖群體;②可以同時檢測同一座位的多個等位基因;③作圖精度高。關(guān)聯(lián)分析的方法最早用在人類遺傳學(xué)，用來挖掘人類的致病基因，應(yīng)用在植物上較晚。關(guān)聯(lián)分析方法目前主要用于小麥、水稻、棉花、大麥、大豆等經(jīng)濟作物［15-17］。在茄子方面還未見報道。本研究對全基因組進行掃描，目的在于初步了解茄子材料的連鎖不平衡現(xiàn)象，本試驗采用SSR標記對國內(nèi)外70個茄子材料進行遺傳多樣性分析、群體結(jié)構(gòu)分析和關(guān)聯(lián)分析，旨在為茄子的親本選擇提供依據(jù)，同時通過分子標記與性狀關(guān)聯(lián)分析，進一步探討與形態(tài)和品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的分子標記位點，為茄子的分子育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗70份國內(nèi)外茄子材料，于2013年1月份在玻璃溫室進行育苗，2013年4月7日定植于金陵科技學(xué)院幕府校區(qū)園藝實驗站塑料大棚內(nèi)，茄子田間形態(tài)調(diào)查參照李錫香等［18］方法。2013年5～6月份測定茄子的各個品質(zhì)指標。各材料及來源詳見表1。

1.2 SSR引物分析

本試驗選自的引物來自 Vilanova等［19］和 Zhu等［20］。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選出具有多態(tài)性的SSR引物54對，由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。2013年3月5日取新鮮植株的葉片，采用簡化CTAB法進行DNA提取。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。PCR總反應(yīng)體系為10.0μl，包括1 × Buffer 1.0 μl，Mg2+0.8 μl，dNTP 0.2 μl，TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)0.1 μl，正、反向引物各0.5 μl，ddH2O 5.9μl，DNA模板1.0μl。PCR程序為95℃ 2 min，94 ℃ 40 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1min，32 個循環(huán);最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染顯色拍照［21］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用人工讀膠的方法，有帶的讀1，無帶的讀0，不確定的記為-9.以NTSYS-pc Ver.2.10計算遺傳相似系數(shù)(Genetic similarity，GS)并按非加權(quán)配對法(UPGMA)和SHAN程序聚類分析?；蝾l率和Shannon指數(shù)通過Popgene32進行統(tǒng)計分析。以Structure 2.3.4軟件［22］進行群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析，估計最佳群體組群數(shù)K，其取值范圍為1～10，將MCMC(Markov chain monte carlo)開始時的不作數(shù)迭代(Length of burn-in period)設(shè)為100 000次，再將不作數(shù)迭代后的MCMC設(shè)為100 000次，迭代次數(shù)(Number of iterations)設(shè)置為5，計算Q參數(shù)，將其作為協(xié)變量。采用 TASSEL 2.0［23］中的 GLM(General linearmodel)模型結(jié)合分子標記數(shù)據(jù)、群體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和表型性狀數(shù)據(jù)進行標記-性狀的關(guān)聯(lián)分析，確定關(guān)聯(lián)位點［24］。

2 結(jié)果

2.1 分子標記多態(tài)性分析

從供試材料中選擇6個表型差異大的材料對68對SSR引物進行篩選，從中選出擴增條帶清晰，重復(fù)性好，多態(tài)性豐富的SSR引物18對，共檢測到130個等位變異，平均每個引物7.2個等位變異，變化范圍2～9個等位變異。等位變異最多的標記為CSM44(圖1)，共檢測到9個等位變異，其次是CSM40，檢測到7個等位變異?；蚨鄻有灾笖?shù)和Shannon指數(shù)變幅分別為0.070 0～0.404 4和0.103 6～0.584 8，平均值分別為0.181和0.263。大多數(shù)材料的遺傳相似系數(shù)分布在0.61至0.82之間，這表明不同茄子材料之間有一定差異，但差異不大，遺傳背景較窄。

2.2 聚類分析

利用18對SSR引物對茄子材料進行鑒定，對數(shù)據(jù)進行聚類分析，結(jié)果(圖2)顯示，在相似系數(shù)0.61處將70份材料分為6大類。第1類包含3個材料，果萼色都為綠色。第2類包含36個材料，在相似系數(shù)0.64處可進一步分為2個亞類，第1亞類主要是長茄，包括9份國內(nèi)長茄、2份荷蘭長茄、1份日本長茄、3份國內(nèi)圓茄和1份日本圓茄。第2亞類主要以紫茄為主，14份國內(nèi)紫茄、4份日本紫茄、2份國內(nèi)綠茄。第3類包括19份材料，在相似系數(shù)0.6處又可分為2個亞類，第1亞類只有45號果色為白色，其他均為紫色或者是紫黑。第2亞類均為紫色，主要以國內(nèi)茄為主，12份國內(nèi)茄、1份菲律賓茄、1份日本茄。第4類主要是長茄，果萼色均為綠紫。第5類為62號扁紅茄，來自于非洲，果色橘紅色，野生種。第6類是果萼色為綠紫，果色都是鮮紫。

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

為了消除關(guān)聯(lián)分析時由于供試材料群體結(jié)構(gòu)引起的偽關(guān)聯(lián)，根據(jù)Evanno等［25］的方法，利用18對引物對70個供試材料進行群體結(jié)構(gòu)檢測，結(jié)果顯示該群體可分為5個亞群，分別為POP1、POP2、POP3、POP4和POP5。根據(jù)每個亞類群中主要顏色所占的比例(Q值)，將Q＞0.6視為血緣單一，Q＜0.6視為具有混合來源［26］，分析不同基因型個體在相應(yīng)亞類群中的遺傳背景(圖3)。結(jié)果顯示，各亞類群間存在明顯的差異。POP1亞類群(紅色)包括16份材料，主要以紫色茄為主，各部分材料Q值均大于0.6，表明種質(zhì)來源單一，遺傳背景不復(fù)雜，同其他類群缺少基因交流。POP2亞類群(綠色)由29份材料組成，果萼色以綠紫為主，有8份材料Q值都在0.6以下，表明其具有混合來源，遺傳背景較復(fù)雜，如傾國69含有較多的POP1遺傳背景，主力長茄品種含有較多的POP5遺傳背景。萬壽龍品種含有較多的POP4、POP5遺傳背景。POP3亞類群(藍色)，由15份材料構(gòu)成，以長筒茄為主。其中有8份材料遺傳背景復(fù)雜，按Q值從大到小依次為西方神茄、麗華、艷麗長、尼爾、扁紅茄、美引茄冠、蘇崎茄、紫塔號;從外形來看，果形、果萼色不同，基因交流較頻繁。POP4亞類群(黃色)，由7份國內(nèi)長茄組成，其中4份材料來源于西南地區(qū)，其混合來源單一。POP5亞類群(淺紫色)，包括3份材料，果色為黑紫色。

圖2 SSR標記的70份材料的UPGMA聚類圖Fig.2 Dendrogram of 70 eggplant varieties analyzed by SSR-UPGMA based on genetic similarities

2.4 SSR標記與農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析

本研究檢測的18對SSR引物，有13對引物的17個位點與測試性狀相關(guān)聯(lián)。結(jié)果(表2)顯示，其中與葉柄長相關(guān)聯(lián)的位點有5個，與單果質(zhì)量、可溶性蛋白質(zhì)、蘆丁、果色、果萼色5個性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點各3個，與株型、首花節(jié)位、可溶性糖3個性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點各有2個，其余的性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點只有1個。其中位點CSM44-1是關(guān)聯(lián)性狀最多的位點，與首花節(jié)位、果形、單果質(zhì)量、葉柄長4個性狀相關(guān)聯(lián)，對4個性狀的變異解釋率分別為46.0%、50.1%、47.5%、42.3%。位點CSM33-5、CSM65-3是關(guān)聯(lián)性狀最少的位點，分別與株高、可溶性固形物關(guān)聯(lián)，對其變異解釋率分別為21.1%、24.7%。位點CSM40-6、CSM47-2、CSM71-6分別與蘆丁、葉柄長、果萼色極顯著相關(guān)(P＜0.01)，其變異解釋率分別達到43.2%、29.8%、26.5%。

分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一個位點與多個性狀相關(guān)聯(lián)和多個位點與同一性狀相關(guān)聯(lián)的情況很普遍。原因可能是蔬菜的許多重要的農(nóng)藝性狀均屬于由多個基因控制的數(shù)量性狀。

3 討論

3.1 茄子遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析

分子標記是鑒定茄子材料親緣關(guān)系有效途徑之一。本研究用SSR對70份茄子材料遺傳多樣性分析，在一定程度上反應(yīng)了70份材料直接的親緣關(guān)系，聚類分析的遺傳相似系數(shù)大多數(shù)在0.56～0.93，平均相似系數(shù)在0.68，在分子水平上遺傳差異不大，這與前人的研究結(jié)果一致［12，27］。在茄子的育種過程中，育種工作者應(yīng)繼續(xù)努力拓寬茄子的遺傳基礎(chǔ)，解決遺傳背景狹窄問題，為茄子品種選育提供豐富的親本。

將群體結(jié)構(gòu)所得的Q值作為協(xié)變量代入回歸分析。以消除供試材料群體結(jié)構(gòu)的偽關(guān)聯(lián)，確保關(guān)聯(lián)分析的準確性［28-29］。本研究基于SSR標記，利用Structure2.3.4軟件的群體結(jié)構(gòu)分析將70個材料分為5個亞類群。其中POP1亞類群主要是國內(nèi)茄，只有4份國外茄子材料，可能是頻繁的商業(yè)化導(dǎo)致基因之間的交流。表明茄子群體結(jié)構(gòu)的劃分與來源有一定的關(guān)系。這和肖熙歐等［30］、孫源文等［31］的研究比較吻合。POP2亞類群主要是紫茄(紫黑、鮮紫、紫紅)。扁圓茄、圓球茄、高圓茄分布在POP1、POP2、POP3、POP5亞類群中，可能是沒有篩選到合適的引物將他們分在一起。長條茄、長羊角茄、長筒茄主要分布在POP1、POP2、POP3 3個亞類群，這與傳統(tǒng)的Bailey［32］茄子分類相符。本試驗部分材料是國外引進的品種，但和中國的材料遺傳系數(shù)較高，可能是育種工作者的育種目標相同，導(dǎo)致遺傳背景相似。其次利用SSR標記進行群體結(jié)構(gòu)分析，必須要有足夠的多態(tài)性位點能覆蓋較全的基因組，才能提高群體結(jié)構(gòu)的準確性，但同其他標記相比，SSR引物產(chǎn)生的多態(tài)性較低，且研究中所使用SSR數(shù)目有限，使得結(jié)果可能產(chǎn)生誤差。

表2 與農(nóng)藝相關(guān)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SSR位點Table 2 SSR loci significantly associated with agronom ic traits in eggplant

3.2 茄子SSR分子標記的關(guān)聯(lián)分析

關(guān)聯(lián)分析(Association analysis)，又稱關(guān)聯(lián)作圖(Association mapping)，首次將關(guān)聯(lián)分析用于植物上的是Hansen等［33］對野生甜菜生長習(xí)性的研究。其發(fā)現(xiàn)在17個引物組合擴增的440個全基因組范圍內(nèi)的AFLP引物中，有2個位點與控制抽薹前是否需要春化的B基因顯著關(guān)聯(lián)。目前關(guān)聯(lián)分析在作物方面主要用在小麥、玉米、水稻、棉花等。印志同等［34］采用71對SSR引物掃描85份糯玉米自交系材料進行耐鹽性鑒定，共檢測到9個標記位點分別與5個耐鹽性狀顯著關(guān)聯(lián)，其中1個位點同時與2個性狀存在顯著關(guān)聯(lián)。王艷平等［35］用45份材料構(gòu)成的品種群體對38個特異性、一致性、穩(wěn)定性(DUS)測試性狀與45個分子標記進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，20個分子標記位點與23個DUS測試性狀相關(guān)聯(lián)。本研究在18對引物上共檢測13對引物的17個位點與茄子的14個數(shù)量性狀相關(guān)聯(lián)(P＜0.05)。其中位點CSM21-4、CSM47-3、CSM63-5與果色顯著相關(guān)，變異解釋率分別為28.4%、19.2%、26.7%。

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