鐘 丹，薛 群，王淑一（杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心，杭州 310023）

人類乳頭瘤病毒（HPV）是一群微小的、無包膜的雙鏈DNA病毒，其DNA長約8kb。目前發(fā)現(xiàn)的HPV基因型已經(jīng)超過了100種［1］。根據(jù)不同基因型HPV致瘤能力的高低，一般將其分為高危型、潛在高危型和低危型3類［2－3］?；A(chǔ)研究和流行病學(xué)調(diào)查研究證據(jù)都表明，HPV特別是高危型HPV的感染是幾乎導(dǎo)致子宮頸癌的必要條件［4］。本研究采用焦磷酸測序技術(shù)，在1個標(biāo)本模板孔中使用多個測序引物，同時對7種 HPV亞型，即 HPV－6、11、16、18、31、33、45基因進(jìn)行擴增檢測，以期為一管式多引物焦磷酸測序技術(shù)在HPV分型檢測中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 志愿參加本次研究的女性患者517例，均簽署知情同意書，年齡19～51歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集和預(yù)處理 用刮板或生理鹽水浸潤的棉棒從陰道和宮頸外口取分泌物和細(xì)胞；在進(jìn)行涂片標(biāo)本細(xì)胞學(xué)檢查的同時，將標(biāo)本放入5mL含有0.05%硫柳汞的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，離心（3 000×g、10min）洗滌2次，沉積細(xì)胞重懸于1mL PBS中，取0.5mL細(xì)胞懸液抽提DNA。

1.2.2 標(biāo)本核酸的提取 按1體積細(xì)胞懸液加入10倍體積的細(xì)胞裂解液［10mmol／L鹽酸三羥甲基氨基甲烷（Tris－HCl），pH7.4，10mmol／L乙二胺四乙酸（EDTA），150mmol／L氯化鈉（NaCl），0.4%十二烷基磺酸鈉（SDS），1.0mg／mL蛋白酶K］，37℃溫育過夜；以等體積酚／氯仿（1∶1），氯仿／異戊醇（24∶1）各抽提2次；加入1／10倍體積的3mol／L、pH5.2乙酸鈉（NaAc）及2.5倍體積無水乙醇，－20℃放置2h或過夜以沉淀DNA；加入1倍體積乙醇洗滌1次；用60μL含RNA酶（100μg／mL）的 TE 溶 液 （10mmol／L Tris－HCl，pH 8.0，1.0mmol／L EDTA）溶解 DNA，37℃溫育30min。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增 （1）半巢式 PCR 擴增HPV通用型引物：MY09引物序列為5′－CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC－3′，MY11 引 物 序 列 為 5′－GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG－3′，其中，M 為 A 或 C、R為 A 或G、W 為 A或T、Y為C或 T；GP6＋引物序列為5′－biotin－GAA AAA ATA AAC TGT AAA TCA TAT TC－3′。（2）PCR 擴增：反應(yīng)體系為20μL，包括1×PCR緩沖液、0.4mmol／L dNTP、0.2μmol／L引物、KODFX PCR擴增酶0.02U／μL、模板2μL；反應(yīng)條件為95℃3min、95℃10s、54℃30s、72℃30s循環(huán)10次，95℃10s、40℃30s、72℃30s循環(huán)30次，72℃5min。（3）對照設(shè)置：每次試驗均設(shè)陽性及陰性對照，以載有6型HPV基因組序列的重組質(zhì)粒（每個反應(yīng)為100pg）為陽性對照，以無HPV基因組序列的人細(xì)胞DNA為陰性對照。（4）凝膠電泳：對擴增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外線下觀察和拍照。

1.2.4 焦磷酸測序 （1）應(yīng)用 QIAGEN PyroMark Q96ID型焦磷酸測序儀配套的單鏈純化裝置從PCR反應(yīng)體系中分離出單鏈DNA；（2）在QIAGEN PyroMark Q96ID型焦磷酸測序儀測序板的每個反應(yīng)孔中分裝45μL測序反應(yīng)液，將分離好的單鏈DNA轉(zhuǎn)入測序板孔，測序板80℃溫浴2min后轉(zhuǎn)至室溫冷卻；（3）將測序板放入測序儀中，新建1個SQA程序，根據(jù)測序儀程序自動計算出的試劑量在試劑倉中加入相應(yīng)體積的試劑，包括酶類、底物熒光素、dATP、dCTP、dGTP、dTTP，運行程序。

1.2.5 PCR－反向點雜交法 采用PCR體外擴增和DNA反向點雜交相結(jié)合的DNA芯片技術(shù)。利用HPV的基因特點設(shè)計特異引物，對23種HPV基因型的目標(biāo)片段進(jìn)行擴增，再將PCR擴增產(chǎn)物與固定在膜條上的包括18種高危型和5種低危型在內(nèi)的分型探針進(jìn)行雜交，依據(jù)雜交信號的有無來判斷HPV感染情況并加以分型。

1.2.6 結(jié)果讀取及分析 根據(jù)GenBank網(wǎng)站上針對不同HPV型別所設(shè)計的引物繼而進(jìn)行測序所得到的序列（表1），通過焦磷酸測序結(jié)果圖讀取HPV基因擴增陽性標(biāo)本中的HPV型別。

表1 焦磷酸測序HPV分型結(jié)果

2 結(jié) 果

2.1 半巢式PCR擴增片段的電泳鑒定 517例標(biāo)本中有218例可成功擴增出明顯的190bp的目的條帶，部分標(biāo)本PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

圖1 半巢式PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.2 焦磷酸HPV分型結(jié)果 將擴增出目的條帶的半巢式PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序分析，采用多引物測序法，根據(jù)表1焦磷酸測序讀取序列，通過分析焦磷酸測序結(jié)果圖讀取HPV型別。采用多引物測序法測序得到的焦磷酸測序結(jié)果圖見圖2。根據(jù)HPV分型讀取序列比對，可對標(biāo)本中的HPV進(jìn)行分型。218例PCR擴增陽性標(biāo)本中，可判斷為HPV－6、11、16、18、31、33、45的標(biāo)本有 62例，其中 HPV－6占 12.9%，HPV－11占11.29%，HPV－16占37.1%，HPV－18占12.9%，HPV－31占6.45%，HPV－33占9.68%，HPV－45占 6.45%。不同型別HPV多重感染標(biāo)本焦磷酸測序結(jié)果圖見圖3。共檢出HPV－16、18多重感染標(biāo)本及HPV－18、45多重感染各1例，檢出率均為1.6%。

圖2 多引物測序法焦磷酸測序圖

2.3 焦磷酸HPV分型與PCR－反向點雜交法檢測一致性分析 本研究中7種HPV型別測序陽性標(biāo)本再次通過PCR－反向點雜交法檢測，結(jié)果兩種方法7中HPV型別的判斷結(jié)果均相符，兩種方法檢測結(jié)果具有良好的一致性。

3 討 論

基因測序是分子診斷領(lǐng)域中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。傳統(tǒng)的基因測序方法是Sanger終止法，該方法一次只能讀取單個基因的序列，因此，對于有眾多基因亞型的病原體感染性疾病，很難獲得理想的測序結(jié)果［5］。焦磷酸測序技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新的序列分析技術(shù)，其分析原理是：核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶的級聯(lián)反應(yīng)，促使熒光素發(fā)光，通過檢測發(fā)光信號而獲得測序結(jié)果。焦磷酸測序技術(shù)最大優(yōu)點是可以實現(xiàn)高通量、高效率，最為重要的是，可同時檢測多至5種以上病原體基因亞型，對于當(dāng)前日益增多的混合型HPV感染無疑具有廣闊的臨床應(yīng)用前景［6］。

本研究采用一管式多引物測序法，根據(jù)臨床相關(guān)性和流行性，設(shè)計了7個測序引物在同一反應(yīng)孔中進(jìn)行測序，可同時檢測的病原體包括高危型 HPV－16、18、31、33，以及與腫瘤形成相關(guān)的HPV－45。據(jù)統(tǒng)計，全球范圍內(nèi)80%的宮頸癌患者都存在上述 HPV亞型單獨或混合感染［2，7］。此外，低危型 HPV－6和HPV－11則在生殖器疣的發(fā)病機制中具有重要作用。本研究結(jié)果證明，與采用通用引物進(jìn)行測序的傳統(tǒng)方法相比，一管式多引物測序法在引物設(shè)計方面有助于更有效地針對不同亞型的特異性區(qū)域，所采用的焦磷酸測序技術(shù)則能夠準(zhǔn)確、快速地分型，從而降低成本，縮短檢測時間。而且，另有研究發(fā)現(xiàn)該方法不僅能夠檢測混合型感染標(biāo)本，還能確定不同型別病原體所占的比例［8］。

雜交法的臨床應(yīng)用已得到普及，但臨床實踐中存在一定的假陰性和假陽性結(jié)果，且不能排除發(fā)生交叉污染的可能性［9］。本研究采用焦磷酸測序技術(shù)檢出218例HPV感染標(biāo)本，并對病原體進(jìn)行了分型，與雜交法檢測結(jié)果比較，二者檢測結(jié)果的符合率是100%。焦磷酸測序法一次性檢測標(biāo)本數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他方法，并能夠同時檢測混合型感染，操作方便，并且能夠較為直觀、準(zhǔn)確地讀取測序結(jié)果。已證實HPV感染是腫瘤、宮頸上皮內(nèi)瘤變和疣的主要致病因素，HPV檢測在上述疾病常規(guī)初篩中的應(yīng)用價值較高，已在臨床中廣泛應(yīng)用，而且，由于不同的HPV型別具有不同的致病性，所以研究HPV檢測方法十分重要［2］。本研究對PCR擴增后的片段進(jìn)行多引物測序序列分析，不僅可以檢測具體型別，還可以對混合型感染中的HPV型別進(jìn)行鑒別，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

［1］Burd EM.Human papillomavirus and cervical cancer［J］.Clin Microbiol Rev，2003，16（1）：1－17.

［2］Munoz N，Bosch FX，de Sanjose S，et al.Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer［J］.N Engl J Med，2003，348（6）：518－527.

［3］Herrero R，Castle PE，Schiffman M，et al.Epidemiologic profile of type－specific human papillomavirus infectionand cervical neoplasia in Guanacaste，Costa Rica［J］.J Infect Dis，2005，191（11）：1796－1807.

［4］Ciszek B，Heimrath J，Ciszek M.The application of human papilloma virus genotyping for the identification of neoplasm lesions in the cervix of women with abnormal cytology smears［J］.Adv Clin Exp Med，2012，21（6）：759－766.

［5］Tsiatis AC，Norris－Kirby A，Rich RG，et al.Comparison of Sanger sequencing，pyrosequencing，and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations：diagnostic and clinical implications［J］.J Mol Diagn，2010，12（4）：425－432.

［6］Gharizadeh B，Kalantari M，Garcia CA，et al.Typing of human papillomavirus by pyrosequencing［J］.Lab Invest，2001，81（5）：673－679.

［7］Bosch FX，Manos MM，Munoz N，et al.Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer：a worldwide perspective.International biological study on cervical cancer（IBSCC）Study Group［J］.J Natl Cancer Inst，1995，87（11）：796－802.

［8］Gharizadeh B，Oggionni M，Zheng B，et al.Type－specific multiple sequencing primers：a novel strategy for reliable and rapid genotyping of human papillomaviruses by pyrosequencing technology［J］.J Mol Diagn，2005，7（2）：198－205.

［9］Tan JH，Garland SM，Tabrizi SN，et al.Hybrid capture II testing for high－risk human papillomavirus DNA in the follow－up of women treated for high－grade cervical intraepithelial neoplasia［J］.Low Genit Tract Dis，2013，17（3）：308－314.