劉義慶，田文君，渠 滕，劉春梅，許 麗，王盛華，朱之煒，張炳昌△（.山東大學附屬省立醫(yī)院檢驗科，濟南 500 ；.山東大學第二醫(yī)院肝病科，濟南 500 ；.山東省濟南市體外診斷試劑工程技術(shù)研究中心 500）

丙型肝炎病毒（HCV）感染是一個世界性的傳染病，全球大約有1.7億人被感染，我國 HCV感染者約4 200 萬人［1］。HCV慢性感染可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化、肝癌等終末期肝臟疾病，嚴重威脅人類健康。HCV是單股正鏈RNA病毒，極易發(fā)生基因變異，根據(jù)其核苷酸序列的差異，可分為6種HCV基因型及不同亞型，根據(jù)2005年新的HCV基因型命名規(guī)則，以阿拉伯數(shù)字表示HCV基因型，以小寫英文字母表示基因亞型。HCV基因分型方法主要包括直接測序法、限制性片段長度多態(tài)性分析法（RFLP）、特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法、特異性探針熒光PCR法、基因芯片法等［2］。HCV基因組的E1、NS5b、C區(qū)直接測序和樹分析是最準確、最經(jīng)典的檢測方法，為HCV基因分型的“金標準”［3］。為了解近年來山東地區(qū)漢族丙型肝炎患者HCV基因型分布情況，本研究通過焦磷酸測序法對153例山東地區(qū)漢族丙型肝炎患者進行HCV基因分型，以期為山東地區(qū)漢族人群丙型肝炎的診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年5月至2013年10月山東省立醫(yī)院門診及住院的153例丙型肝炎患者，均為山東地區(qū)漢族且均未接受過抗病毒治療。其中男71例，女82例，年齡16～93歲，平均年齡（46.17±18.37）歲。

1.2 方法 無菌采集外周靜脈血5mL，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA－K2）抗凝，在收集后2h內(nèi)，室溫下3 000 r／min離心8 min，將血漿轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，－70℃保存留做 HCVRNA檢測。RNA檢測結(jié)果大于103IU／mL的標本進一步做焦磷酸測序并做HCV基因分型。

1.2.1 HCV－RNA檢測 采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（FQ－RT－PCR）技術(shù)，HCV核酸定量檢測試劑盒由羅氏診斷產(chǎn)品有限公司（上海）提供，儀器為COBAS AmpliPrep－COBAS TaqMan48。由基因擴增實驗室工作人員嚴格按照說明書操作，每次實驗中均設(shè)置臨界陽性、強陽性對照和質(zhì)控，HCVRNA檢測的線性反應(yīng)范圍為43～6.9×107IU／mL，檢測下限為15IU／mL。

1.2.2 HCV基因測序和分型 采用德國Qiagen公司Pyro－Mark Q24型焦磷酸測序－遺傳分析系統(tǒng)對RNA檢測結(jié)果大于103IU／mL的標本進行基因測序和分型，該系統(tǒng)包括序列分析儀PyroMark Q24、用于制備單鏈DNA的PyroMark Q24真空工作站、分析用的PyroMark Q24軟件以及相關(guān)試劑，嚴格按照說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學處理 首先對HCV－RNA病毒載量數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換（log10），再用SPSS21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析處理，運用單因素方差分析比較HCV各亞型之間病毒載量是否有統(tǒng)計學差異；以α＝0.05為檢驗水準，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 HCV基因分型結(jié)果 本次研究共檢出5種HCV基因亞型，分別為 1a、1b、2a、3a、3b，所占比例依次為3.92%（6／153）、65.36%（100／153）、28.76%（44／153）、1.31%（2／153）、0.65%（1／153）。以1b為主，其次為2a，1a、3a、3b少見，未檢出其他基因亞型。

2.2 HCV基因亞型病毒載量分析 運用單因素方差分析，對HCV基因亞型之間病毒載量是否存在差異進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果F＝4.376，P＝0.006，即各 HCV基因亞型之間病毒載量不全相同。多重比較（LSD方法）表明1b亞型病毒載量明顯高于2a亞型，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而1a與1b、2a、3a之間，1b與3a之間，2a與3a之間病毒載量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），詳見表1。

表1 各HCV基因亞型病毒載量水平（）

表1 各HCV基因亞型病毒載量水平（）

注：－表示無數(shù)據(jù)；與2a亞型比較，aP＜0.05。

分型HCV－RNA單因素方差分析（IU／mL，×106） LSD法（log10）1a 2.54±3.06 5.91±0.86 1 b 3.08±4.79 5.91±0.98a 2a 7.48±9.54 5.28±0.96 3 a 2.05±2.69 5.89±1.00 3 b－－

3 討 論

HCV感染主要通過輸血或血液制品傳播，目前HCV在全世界的感染率約為2%，我國約為3.2%。對于HCV感染目前還無有效的疫苗和治療方法，不同的HCV基因型生物活性不同，病情進展和抗病毒治療時間和療效也不盡相同。HCV基因分型檢測有助于了解地域分布，探討其傳播途徑和發(fā)展。

由于人群遺傳背景、人員流動性等不同，HCV基因型分布呈明顯的國籍和地域差異［4］。美國、巴西和歐洲西北部以1a型占絕大多數(shù)；亞洲、遠東、歐洲東西部以1b型為主；2a和2b型多分布于亞洲和歐洲；新加坡、泰國3a型多見；4a多見于中東和北非；5a局限于南非；6a常見于香港、越南等亞洲南部。中國大陸大部分地區(qū)HCV基因型以1b和2a型為主，其中1b型占70%～80%，在部分南方城市甚至高達90%，自南向北2a型所占的比例逐漸增多。本研究表明，近年來山東地區(qū)漢族丙型肝炎患者HCV基因分型以1b為主，2a型次之，與吉林、上海、福建等中國大部分地區(qū)報道相似［5－7］，與甘肅地區(qū)2a型較1b型更常見不同［8］，也與廣東地區(qū)6a型高于2a型成為僅次于1b型的常見亞型不同［9－10］，說明中國大陸地區(qū)的HCV基因型存在區(qū)域性分布。

現(xiàn)有研究表明HCV基因型與疾病進展、干擾素治療效果密切相關(guān)［11］。本文研究發(fā)現(xiàn)1b亞型組病毒載量明顯高于2a組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這與前期研究結(jié)論一致。1b型病毒復(fù)制能力較強，對干擾素的持續(xù)病毒學應(yīng)答（SVR）較低，僅為20%左右，更易發(fā)展為慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌。干擾素對2a型治療效果要明顯好于1b型，其SVR率可達67%［5］。可以看出，HCV基因分型有利于臨床醫(yī)師針對患者感染的基因型制定個體化治療方案，提高治療效果。本研究中其他亞型之間病毒載量未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學差異，可能與其他亞型例數(shù)較少有關(guān)。

本文采用焦磷酸測序法對山東地區(qū)153例漢族丙型肝炎患者進行HCV基因分型，并對不同基因型之間的病毒載量進行了分析，發(fā)現(xiàn)山東地區(qū)漢族丙型肝炎患者基因型以1b和2a為主，且病毒載量1b明顯高于2a，這為山東地區(qū)漢族人群丙型肝炎的預(yù)防、診斷和治療提供理論依據(jù)和幫助。

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