李景華，趙炎蔥，韓 光

（1.河南大學(xué) 天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開(kāi)封475001； 2.河南大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，河南 開(kāi)封475001；3.河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開(kāi)封475001）

L－肉毒堿（L－Carnitine）亦稱維生素BT，其化學(xué)式為C7H15O3N，相對(duì)分子質(zhì)量為162.2，是人類必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有抗心肌缺血，抗心率失常，促進(jìn)脂類代謝，降低血脂，治療肥胖等作用［1－2］，由此成為研究的熱點(diǎn).近些年，市場(chǎng)上出現(xiàn)了多種以L－肉毒堿為主要成分的降血脂藥物.L－肉毒堿的檢測(cè)方法主要有：高效液相色譜法［3－6］，酶技術(shù)測(cè)定法［7］，滴定法［8］等.滴定法較為粗放，很難測(cè)出L－肉毒堿的準(zhǔn)確含量；酶技術(shù)測(cè)定法主要用于血液制品；液相色譜法具有操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛用于L－肉毒堿的分析.已報(bào)道的液相色譜法中均采用C18柱［3－6］，本課題組也在本藥品測(cè)定中利用這些方法進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，但出現(xiàn)保留時(shí)間短，分離度不好，峰形差等現(xiàn)象，其原因可能是L－肉毒堿的極性較大，極易溶于水.氨基柱兼具正相與反相柱的性質(zhì)，具有適當(dāng)?shù)臉O性，對(duì)L－肉毒堿具有較適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間，且峰形較好.本文采用HPLC法，利用氨基柱對(duì)降血脂藥物中的L－肉毒堿的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，該測(cè)試方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高，為有效控制該類含L－肉毒堿的降血脂藥物質(zhì)量提供了依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC 2010A高效液相色譜儀（日本島津公司，LC 2010四元體系混合泵，LC 2010紫外檢測(cè)器，CLASS VP色譜工作站），KQ 300CDE型數(shù)控超聲波發(fā)生器（昆山市超聲儀器有限公司）；AG135電子天平（梅特勒－托利多公司）.

L－肉毒堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為1105072－201204，純度≥99.65%），降血脂藥物（市售，批號(hào)為20121025、20121106、20121115，主要由銀杏提取物、L－肉毒堿和紅曲粉及β－環(huán)糊精組成，制劑規(guī)格0.3g），乙腈為色譜純（天津四友化學(xué)試劑有限公司）；KH2PO4及NaOH均為分析純；水為二次蒸餾水.

1.2 色譜條件

色譜柱：Kromasil氨基柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈∶KH2PO4溶液（6.81g／L，NaOH調(diào)至pH＝4.7）＝65∶35；流速：1.0mL／min；柱溫：30℃.

測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：取L－肉毒堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，在190～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)205nm處有最大吸收，故選擇205nm作為檢測(cè)波長(zhǎng).

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取4mgL－肉毒堿標(biāo)準(zhǔn)品置于10mL容量瓶中，加入流動(dòng)相適量，超聲溶解，室溫冷卻；搖勻，用流動(dòng)相定容至刻度；用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得.

1.4 樣品溶液的配制

取降血脂藥物適量，除去膠囊殼，取出內(nèi)容物，碾碎，混勻；精密稱取粉末30mg加入25mL容量瓶中，加入流動(dòng)相適量，超聲溶解，冷卻；搖勻，用流動(dòng)相定容至刻度；用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得樣品溶液.

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取L－肉毒堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別采用0.5、5、15、20和25mL進(jìn)樣，記錄得色譜圖（圖1），對(duì)應(yīng)的峰面積分別為8 542、84 097、252 192、336 583、421 565.以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)作回歸曲線，得回歸方程y＝16 848.98x－125.89，（r＝0.999 9）（圖2）.結(jié)果表明，當(dāng)L－肉毒堿的濃度為0.4g／L時(shí)，其注射體積在0.5～10mL范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系.

圖1 L－肉毒堿標(biāo)樣的色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard L－camitine conten

圖2 回歸曲線圖Fig.2 Regression curve

2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取樣品溶液（批號(hào)為20121106），分別在0、1、2、4、8、12、24h后進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10μL.記錄樣品的峰面積，計(jì)算得到L－肉毒堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（表1），并由此計(jì)算出質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為0.80%，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定.

表1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Testing results of stability

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取L－肉毒堿標(biāo)樣溶液（0.4g／L），連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量均為10μL.測(cè)得樣品的峰面積如表2所示，按峰面積計(jì)算得標(biāo)樣的RSD為0.40%.

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Testing results of precision

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取6份同一批降血脂藥物樣品850mg（批號(hào)為20121106）制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，記錄樣品的峰面積，計(jì)算得出左旋肉毒堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（見(jiàn)表3），由此得到RSD為0.80%.

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Testing results of repeatability

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

取降血脂藥物細(xì)粉（三批次各取幾粒混合均勻后研碎），精密稱取適量藥物加入25mL量瓶中，加入不同體積的0.4g／L的L－肉毒堿標(biāo)準(zhǔn)品，加入量分別為制劑中L－肉毒堿含量的80%、100%及120%，共制備成9份供試品溶液.分別進(jìn)樣10μL，測(cè)試并記錄峰面積（見(jiàn)表4），計(jì)算得平均回收率為99.53%，RSD為0.31%.

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Testing results of recoery test

2.6 樣品測(cè)定

取三批樣品，按樣品溶液制備方法制備樣品溶液.取L－肉毒堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液，各進(jìn)樣三針，進(jìn)樣量均為10μL，記錄色譜圖（見(jiàn)圖3和圖4）.得到的峰面積按外標(biāo)法計(jì)算降血脂藥物中L－肉毒堿含量，結(jié)果三個(gè)批號(hào)樣品（20121025、20121106、20121115）中的L－肉毒堿含量分別為32.69%、33.75%和32.11%.

圖3 L－肉毒堿標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.3 Chromatogram of L－Carnitine standard substance

圖4 降血脂藥物樣品的色譜圖Fig.4 Chromatogram of lipid－lowing drug

2.7 討論

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中使用紫外分光光度計(jì)掃描標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液，排除藥物中其他發(fā)光物質(zhì)的干擾，選定了測(cè)定波長(zhǎng)；然后參考文獻(xiàn)［3，6，9］進(jìn)行色譜柱的選擇.首先對(duì)Kromasil氨基柱和waters C18柱進(jìn)行了比較，實(shí)驗(yàn)表明，用流動(dòng)相：乙腈∶KH2PO4＝65∶35，Kromasil氨基柱能將L－肉毒堿與其他雜質(zhì)進(jìn)行很好的分離，出峰時(shí)間較合適（8min左右），且峰形較好；而采用waters C18柱，無(wú)論如何調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，出峰時(shí)間均在2 min以內(nèi)，不能將L－肉毒堿與溶劑峰或其他雜質(zhì)峰進(jìn)行很好的分離，所以本實(shí)驗(yàn)選擇Kromasil柱為分析柱.與此前文獻(xiàn)比較，雖然相似的測(cè)定方法較多，但采用氨基柱的尚未見(jiàn)到，且流動(dòng)相組成也未見(jiàn)有相似的.

3 結(jié)論

本文作者以L－肉毒堿為指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定方法的研究，色譜條件采用Kromasil NH2柱為色譜柱，以乙腈∶KH2PO4＝65∶35為流動(dòng)相，流速為1.0mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm.方法學(xué)驗(yàn)證的結(jié)果顯示，本方法具有較高的準(zhǔn)確度，保留時(shí)間長(zhǎng)短適宜，重復(fù)性和再現(xiàn)性均比較好，且操作簡(jiǎn)單，可用于降血脂藥物中L－肉毒堿含量的測(cè)定和相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的控制.

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