郭清 吳小華 楊波 呂英璞 徐峰 張少靜

趨化因子CXCL12與其特異性受體CXCR4構(gòu)成的CXCL12-CXCR4生物軸在多種腫瘤的播散和器官特異性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。Kijima等［1］研究證實(shí)，CXCL12-CXCR4生物軸與卵巢表面上皮的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，約80%的卵巢癌組織中有CXCL12的受體CXCR4的表達(dá)，在95%的卵巢癌腹水中發(fā)現(xiàn) CXCL12，而正常的卵巢上皮中卻沒有表達(dá)。本研究以裸鼠為研究對(duì)象進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，來更好地說明兩者之間的相關(guān)性，為卵巢腫瘤的發(fā)病機(jī)制提供新的依據(jù)，為其治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 腫瘤細(xì)胞:卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞SKOV3由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供;SKOV3/CXCR4細(xì)胞、SKOV3/neg細(xì)胞由本課題組前期制備［2］。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào):SCXK(京)2005-0013。

1.2 方法

1.2.1 穩(wěn)定表達(dá)趨化因子受體CXCR4卵巢癌細(xì)胞株的建立與鑒定:具體構(gòu)建與鑒定方法參考文獻(xiàn)［3］。

1.2.2 細(xì) 胞 培 養(yǎng):SKOV3/CXCR4、SKOV3/neg、SKOV3三種細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml和鏈霉素100μg/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液中;在37℃、5%CO2條件下孵育;以0.25%(w/v)的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.3 SKOV3/CXCR4、SKOV3/neg、SKOV3 三種細(xì)胞裸鼠腹腔移植瘤模型的建立和治療:4～6周齡，體重16～18 g，將36只裸鼠按照體重大小編號(hào)，隨機(jī)分為3組，取3種細(xì)胞懸液4×106個(gè)(200μl)于裸鼠左下腹注入腹腔。自注入腫瘤細(xì)胞后第2天起［4，5］，將每組裸鼠又隨機(jī)分為對(duì)照組和處理組，對(duì)照組腹腔內(nèi)0.9%氯化鈉溶液0.2 ml，處理組腹腔內(nèi)注射CXCR4拮抗劑AMD3100，用量0.01 mg/g，每只裸鼠每次注射0.2 ml;同時(shí)每組均腹腔內(nèi)注射 CXCL12 0.2 ml，濃度為100 ng/ml，每2天注射1次，連用2周共7次。

1.2.4 荷瘤裸鼠生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察:荷瘤裸鼠接種細(xì)胞后，每日觀察裸鼠的精神狀況、皮膚、飲食、活動(dòng)能力等，于移植腫瘤后第7天起隔日測(cè)量裸鼠的腹圍、體重，觀察腹腔移植瘤生長(zhǎng)情況，計(jì)算各組小鼠的生存天數(shù)。

1.2.5 荷瘤裸鼠自然死亡后的解剖情況:對(duì)自然死亡裸鼠進(jìn)行解剖，檢查腹水、心、肝、脾、肺、腎、腦、子宮卵巢、腹膜、橫隔、網(wǎng)膜、腸系膜等臟器腫瘤轉(zhuǎn)移情況，同時(shí)觀察腹腔成瘤數(shù)、重量情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，行t檢驗(yàn);兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn);裸鼠平均存活天數(shù)的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn);對(duì)各組數(shù)據(jù)組間行配對(duì)t檢驗(yàn);P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤裸鼠的體重對(duì)比 SKOV3/CXCR4、SKOV3/neg及SKOV3三種卵巢癌細(xì)胞接種于裸鼠腹腔后1周左右荷瘤裸鼠的腹圍相無明顯的差別，3組裸鼠的對(duì)照組和處理組體重差比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 3組裸鼠的對(duì)照組和處理組體重差相比有明顯的差別

2.2 荷瘤裸鼠的生存及死亡情況 接種SKOV3/CXCR4細(xì)胞的裸鼠對(duì)照組的與處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);接種SKOV3/neg細(xì)胞的裸鼠對(duì)照組的平均生存期與處理組裸鼠比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);接種SKOV3細(xì)胞的裸鼠平均生存期與處理的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);3組裸鼠對(duì)照組的平均生存期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表2。

2.3 荷瘤裸鼠的腹腔移植瘤情況的對(duì)比 接種SKOV3/CXCR4細(xì)胞裸鼠的對(duì)照組腹腔移植瘤的平均個(gè)數(shù)和平均重量與處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);接種SKOV3/neg細(xì)胞的裸鼠對(duì)照組腹腔內(nèi)

表2 3組裸鼠的對(duì)照組和處理組生存時(shí)間比較

表3 3組裸鼠的對(duì)照組和處理組腹腔移植瘤的個(gè)數(shù)比較n=6，個(gè)，±s

表3 3組裸鼠的對(duì)照組和處理組腹腔移植瘤的個(gè)數(shù)比較n=6，個(gè)，±s

組別 對(duì)照組 處理組 t值 P值SKOV3/CXCR4 87.67±1.86 80.17±4.58 4.04 0.01 SKOV3/neg 79.17±2.32 79.83±3.25 -1.20 0.29 SKOV3 78.16±1.17 77.67±3.33 0.47 0.66 F值48.09 0.78 P值 ＜0.05 ＞0.05

表4 3組裸鼠的對(duì)照組和處理組腹腔移植瘤的重量比較n=6，g，±s

表4 3組裸鼠的對(duì)照組和處理組腹腔移植瘤的重量比較n=6，g，±s

組別 對(duì)照組 處理組 t值 P值SKOV3/CXCR4 3.74±0.11 2.83±0.10 13.44 0.00 SKOV3/neg 2.82±0.13 2.76±0.11 2.53 0.06 SKOV3 2.82.±0.12 2.84±0.11 -0.89 0.42 F值89.03 1.00 P值 ＜0.05 ＞0.05

3 討論

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤之一，病死率居女性生殖道惡性腫瘤之首。與其他多種類型的癌不同，卵巢癌的主要轉(zhuǎn)移途徑不是通過血管，而是腹腔轉(zhuǎn)移，由于在腹腔的廣泛種植和轉(zhuǎn)移常常引起嚴(yán)重腹水和腸梗阻，所以卵巢癌的腹腔轉(zhuǎn)移是直接引起患者死亡的主要原因。因此深入了解卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移的機(jī)制十分重要。

腹腔微環(huán)境是影響卵巢癌轉(zhuǎn)移方式的重要因素，腹腔微環(huán)境中含有許多細(xì)胞因子，包括CXCL12及其受體 CXCR4、溶血磷脂酸(lysophosphatidic，LPA)及其受體及腹膜間皮細(xì)胞等，其中趨化因子CXCL12即基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(strmal cell derived factor-1，SDF-1)，與其趨化因子受體CXCR4在介導(dǎo)惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Jiang等［2］首次采用免疫組化的方法分析CXCR4蛋白在正常卵巢表面上皮和卵巢上皮性癌組織的定位表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CXCL12和CXCR4蛋白在卵巢上皮性癌起源的正常卵巢表面上皮無表達(dá)，而共表達(dá)在卵巢皮質(zhì)的卵泡細(xì)胞。在良性和交界性上皮性卵巢腫瘤中CXCR4蛋白陽性表達(dá)率為88%和90%，均為細(xì)胞核著色;CXCL12蛋白陽性表達(dá)率100%和88%，均為細(xì)胞質(zhì)著色。在卵巢惡性上皮性癌原發(fā)灶中癌細(xì)胞的CXCR4的陽性率為59%，大多數(shù)為細(xì)胞質(zhì)著色;CXCL12蛋白陽性率則為91%。我們前期的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CXCL12單獨(dú)作用可促進(jìn)SKOV3/CXCR4細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，這與Scotton等［6，7］報(bào)道相一致。

本研究結(jié)果顯示三組裸鼠生存時(shí)間、腹腔移植瘤的個(gè)數(shù)和重量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，CXCL12濃度越高，受試裸鼠腹腔移植瘤個(gè)數(shù)越多，重量越大，生存時(shí)間越短，而且CXCL12的作用依賴于CXCR4的存在，CXCR4拮抗劑可以控制腫瘤生長(zhǎng)，這從體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)一步說明CXCL12-CXCR4生物軸與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近期，有研究表明高CXCL12的表達(dá)的卵巢癌患者較地表達(dá)的卵巢癌患者有很低的生存，所以建議高表達(dá)的卵巢癌患者應(yīng)該使用抗CXCL12-CXCR4治療［8］。這與我們的研究一致。

總之，CXCL12-CXCR4生物軸在實(shí)驗(yàn)水平與卵巢癌的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，它不僅可作為腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)及預(yù)后因素，而且已成為腫瘤治療的新方向，干擾CXCL12-CXCR4生物軸有可能成為治療卵巢癌的一個(gè)有意義的分子靶點(diǎn)。

1 Kijima T，Maulik G，Ma PC，et al.Regulation of cellular proliferarion，cytoskeletal function，and signal transduction through CXCR4 anf c-Kit in small cell lung cancer cells.Cancer Res，2002，62:6304-6311.

2 Jiang YP，Wu XH，Shi B，et al.Expression of chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 in human epithelial ovarian cancer:an independent prognostic factor for tumor progression.Gynecol Oncol，2006，103:226-233.

3 郭清，吉向麗，吳小華，等.穩(wěn)定表達(dá)趨化因子受體CXCR4卵巢癌細(xì)胞株的建立與鑒定.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，23:2148-2151.

4 Müller A，Homey B，Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis.Nature，2001，410:50-56.

5 Singh B，Cook KR，Martin C，et al.Evaluation of a CXCR4 antagonist in a xenograft mouse model of inflammatory breast cancer.Clin Exp Metastasis，2010，27:2330-2340.

6 Scotton CJ，Wilson JL，Milliken D，et al.Epithelial cancer cell migration:a role for chemokine receptors?Cancer Res，2001，61:4961-4965.

7 Balkwill F.TNF-alpha in promotion and progression of cancer.Cancer Metastasis Rev，2006，25:409-416.

8 Popple A，Durrant LG，Spendlove I，et al.The chemokine，CXCL12，is an independent predictor of poor survival in ovarian cancer.Br J Cancer，2012，27，106:1306-1313.