劉玉琴，謝 誼，彭艷梅，王實(shí)強(qiáng)，楊 瑛*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

HPLC測(cè)定山銀花藥材中常春藤皂苷元的含量

劉玉琴1，2，謝 誼2，彭艷梅2，王實(shí)強(qiáng)2，楊 瑛1*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

目的 建立山銀花藥材中的常春藤皂苷元含量的測(cè)定方法。方法 以鹽酸-乙醇溶液為水解溶劑，山銀花樣品加熱回流4 h，再用三氯甲烷萃??；采用HPLC，以Waters Symmetry C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，甲醇-0.4%冰醋酸水溶液（80∶20）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，測(cè)定常春藤皂苷元含量。結(jié)果 山銀花中常春藤皂苷元的線性范圍為2～12 μg，平均加樣回收率99.0%，RSD為1.9%。不同產(chǎn)地山銀花的常春藤皂苷元含量差異較大，湖南隆回野生的含量高達(dá)2.8%，而云南、貴州產(chǎn)的未檢出。結(jié)論 所建立方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，可用于山銀花藥材中常春藤皂苷元的含量測(cè)定。

山銀花；常春藤皂苷元；酸水解；含量測(cè)定；高效液相色譜法

山銀花是我國(guó)常用的一味傳統(tǒng)中藥材，從2005年版《中華人民共和國(guó)藥典》開(kāi)始，將金銀花與山銀花分列為兩項(xiàng)，規(guī)定金銀花的植物來(lái)源只有忍冬1種；山銀花植物來(lái)源有3種，而2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》又新增了1個(gè)品種，故山銀花植物來(lái)源一共有4種， 分別為忍冬科植物灰氈毛忍冬 Lonicera macranthoides Hand-Mazz.、 紅腺忍冬 Lonicera hypoLauca Miq.、華南忍冬 Lonicera confuse DC.或黃褐毛忍冬Lonicera fuLvotomentosa Hsu et S.C.Cheng，其為上述4種植物的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，常用于熱毒血痢、風(fēng)熱感冒等[1]。

山銀花所含化學(xué)成分多樣，主要含黃酮類、有機(jī)酸類、苷類和揮發(fā)油類等[2-3]。其中苷類成分主要為常春藤皂苷類，此類成分是山銀花中除綠原酸類成分之外所含的主要藥效成分，故2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》在2005年版的基礎(chǔ)上中增加了灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙作為山銀花藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，這兩種皂苷均屬于常春藤皂苷，由于這兩種皂苷只有未端紫外吸收，藥典采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）測(cè)定這兩種皂苷的含量。本研究擬用HPLC測(cè)定山銀花藥材中皂苷經(jīng)酸水解后得到的常春藤皂苷元的含量，以間接控制山銀花藥材中總?cè)圃碥盏暮俊，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

LC-10AT高效液相色譜儀和SPD-10AVP紫外可見(jiàn)檢測(cè)器(日本島津公司)；N2000雙通道色譜工作站 (浙江大學(xué)智能信息工程研究所)；AE240型電子分析天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2 對(duì)照品與藥材

常春藤皂苷元對(duì)照品 （中國(guó)食品藥品檢定研究所，供含量測(cè)定用，批號(hào)：111733-201205）；山銀花藥材：2批采于湖南隆回，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所生藥室鑒定，為忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花；另7批購(gòu)于湖南長(zhǎng)沙、廣西、四川、云南及貴州等地藥房，種屬不詳；樣品來(lái)源見(jiàn)表2。

1.3 試劑

甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：WatersSymmetryC18(150 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.4%冰醋酸水溶液（80∶20）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。對(duì)照品與供試品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 常春藤皂苷元對(duì)照品（A）和山銀花藥材（B）的HPLC圖

2.2 供試品溶液的制備

取山銀花藥材粉末 （過(guò)四號(hào)篩）0.2 g，精密稱定，置 100 mL錐形瓶中，精密加入 50%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL于100 mL圓底燒瓶中，加入濃鹽酸3 mL，加熱回流4 h，靜置，冷卻后，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，三氯甲烷提取6次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

取常春藤皂苷元對(duì)照品10.0 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得常春藤皂苷元對(duì)照品儲(chǔ)備液（1.00 mg/mL）。精密量取該儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成濃度為500 μg/mL的溶液，即得。

2.4 線性關(guān)系的考察

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液2、4、6、8、10、12 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄各色譜峰面積，以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X，μg）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：

常春藤皂苷元在2~12 μg線性范圍內(nèi)與峰面積成良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品溶液（500 μg/mL）10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，記錄各次峰面積。結(jié)果得峰面積的RSD為0.9%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份（湖南隆回種植）山銀花藥材粉末（過(guò)四號(hào)篩）按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h精密量取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄各次峰面積，計(jì)算得常春藤皂苷元峰面積的RSD為1.1%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份（湖南隆回種植）山銀花藥材粉末（過(guò)四號(hào)篩）6份，每份0.2 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取各溶液10 μL，注入液相色譜儀，按外標(biāo)法計(jì)算常春藤皂苷元的含量。6份樣品中常春藤皂苷元的平均含量為21.3 mg/g，其RSD為1.9%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量 （湖南隆回種植）的山銀花粉末6份，每份約0.1 g，精密稱定，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液 （酸水解時(shí)精密加入對(duì)照品適量），精密量取10 μL，注入色譜儀，記錄常春藤皂苷元峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定

取所收集的9批不同產(chǎn)地的山銀花藥材，每批各2份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液和“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，以干燥品計(jì)算，得樣品中常春藤皂苷元的平均含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 9批山銀花中常春藤皂苷元含量 （n=2）

3 討論

樣品處理方法的選擇：硫酸酸水解[4]：采用2 mol/mL的硫酸溶液對(duì)山銀花樣品中的皂苷進(jìn)行水解，再用三氯甲烷為溶劑索氏提取常春藤皂苷元。測(cè)得的常春藤皂苷元含量較高，提示該法對(duì)常春藤皂苷元的提取較為完全，但是此法較費(fèi)時(shí)，整個(gè)過(guò)程歷時(shí)10 h左右；鹽酸-乙醇水解，石油醚（60～90℃）萃取：此法測(cè)得的常春藤皂苷元含量較硫酸水解的低得多。鹽酸-乙醇水解，三氯甲烷萃?。捍朔y(cè)得的常春藤皂苷元含量與硫酸水解的接近；鹽酸-乙醇水解-二氯甲烷萃?。捍朔y(cè)得的常春藤皂苷元含量最低。從操作是否簡(jiǎn)便、時(shí)間長(zhǎng)短及對(duì)皂苷元提取完全與否等方面綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)采用鹽酸-乙醇水解皂苷，再采用三氯甲烷萃取皂苷元，采用此法常春藤皂苷水解較為徹底，對(duì)皂苷元的提取也比較完全，且操作相對(duì)較簡(jiǎn)便，耗時(shí)較少。

流動(dòng)相的篩選：本實(shí)驗(yàn)對(duì)甲醇-水、甲醇-冰醋酸水溶液這兩種流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了比較篩選，甲醇-水系統(tǒng)無(wú)論怎樣調(diào)節(jié)兩者比例均未得良好峰形的峰，而換用甲醇-0.4%冰醋酸水溶液系統(tǒng)作為流動(dòng)相時(shí)得到的常春藤皂苷元峰形好，柱效高，推測(cè)與常春藤皂苷元結(jié)構(gòu)中含有羥基和羧基有關(guān)，故經(jīng)試驗(yàn)最終選定甲醇-0.4%的冰醋酸水溶液作為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：常春藤皂苷元在205 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，但由于甲醇的截止波長(zhǎng)為205 nm，選用此波長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)時(shí)溶劑有吸收，對(duì)測(cè)定造成干擾，故選用210 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本次試驗(yàn)收集的山銀花藥材分別來(lái)自湖南、廣西、四川、貴州、云南5個(gè)省9批樣品，常春藤皂苷元含量測(cè)定結(jié)果顯示，來(lái)源于不同省的山銀花的含量具有較大的差異，湘產(chǎn)的山銀花含量較高，而在云南、貴州產(chǎn)的未檢測(cè)出常春藤皂苷元。

2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器來(lái)測(cè)定山銀花中2種皂苷的含量，實(shí)驗(yàn)操作不方便，需配置高壓氮?dú)饣蚩諝猓O(shè)備較昂貴，使用成本高，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢氣有害，加之其檢測(cè)的靈敏度較紫外檢測(cè)器的低。而本文建立了RP-HPLC測(cè)定山銀花中常春藤皂苷元含量，操作簡(jiǎn)便，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，方法重復(fù)性好，可作為山銀花質(zhì)量控制的有效方法。

[1]國(guó)家藥典編輯委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：28-29.

[2]粟時(shí)穎，鄭 興，廖端芳.山銀花研究進(jìn)展[J].南華大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，37(6)：744.

[3]王志萍，鄧家剛，王 勤，等.山銀花研究的最新進(jìn)展[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，11(4)：59-60.

[4]馬雙成，劉 燕，畢培曦，等.RP-HPLC法測(cè)定金銀花藥材中常春藤皂苷元及齊墩果酸的含量[J].藥物分析雜志，2006，26(7)：885-887.

（本文編輯 徐愛(ài)良）

HPLC Determination of Hederagenin in Flos Lonicerae Confusae

LIU Yuqing1,2,XIE Yi2,PENG Yanmei2,WANG Shiqiang2,YANG Ying1*
(1.Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China; 2.Research Institute of Chinese Medicine,Hunan Academy of CM,Changsha,Hunan 410013,China)

ObjectiveTo establish a new method for the determination of hederagenin in Flos Lonicerae Confusae.MethodsThe herb was hydrolyzed with hydrochloric acid-ethanol for 4 hours at 80℃ and the hederagenin was extracted with chloroform and analyzed by HPLC.The Waters Symmetry-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）was used with the mobile phase of methanol-0. 4%glacial acetic acid(80:20),the flow rate was 1.0 mL/min,the column temperature was 30℃, the detected wavelength was 210 nm.Results The linear range of hederagenin was 2～12μg,the recovery rate was 99.0%,RSD was 1.9%.The content of hederagenin in Flos Lonicerae Confusae was varied with growing areas.The content of hederagenin of wild species from Longhui of Hunan province is up to 2.8%,while the hederagenin of the species from Yunnan and Guizhou province has not been detected.ConclusionThe developed method is convenient,precision and repeatability,which can be used to determine the content of hederagenin in Flos Lonicerae Confusae.

Flos Lonicerae Confusae;hederagenin;acid hydrolysis;content determination;HPLC

*楊 瑛，女，研究員，E-mail：fanfeihe@126.com。

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.03.008.028.03

2013－10－27

長(zhǎng)沙市科技局科技攻關(guān)資金專項(xiàng)資助(K1203019-31)；湖南省屬科研機(jī)構(gòu)技術(shù)創(chuàng)新發(fā)展專項(xiàng)資助（2012TF1005）。

劉玉琴，女，在讀碩士研究生，研究方向：藥物化學(xué)。

·名醫(yī)擷華·