金 玲，何小進(jìn)，尹玲桃，江興林*

（湖南懷化醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校診斷教研室，湖南 懷化 418000）

神經(jīng)節(jié)苷脂對腦癱大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)Nestin、NGF表達(dá)的影響

金 玲，何小進(jìn)，尹玲桃，江興林*

（湖南懷化醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校診斷教研室，湖南 懷化 418000）

目的觀察神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1)對腦癱大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)巢蛋白（Nestin）、神經(jīng)生長因子（NGF）表達(dá)的影響，探討GM1促進(jìn)腦癱神經(jīng)修復(fù)的可能機(jī)制。方法選擇出生10周雄性SD大鼠200只，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組60只，腦癱模型140只，再分為模型組70只，腹腔注射生理鹽水；GM1組70只，腹腔注射GM1。分別在術(shù)后0～24 h的7個時間點(diǎn)利用酶聯(lián)免疫法檢測大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)Nestin、NGF表達(dá)情況，并在實(shí)驗(yàn)前和后1～4 d觀察大鼠的體質(zhì)量變化情況。 結(jié)果 （1）大鼠大腦皮質(zhì)區(qū) Nestin表達(dá) GM1組 0～24 h、模型組 0～12 h明顯高于假手術(shù)組（P<0.01）；GM1組 16～24 h明顯高于模型組 （P<0.01）。（2）GM1組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NGF表達(dá)0～24 h明顯高于模型組 （P＜0.05）和假手術(shù)組 （P＜0.01）。模型組 NGF 表達(dá)僅 0、4、8 h 高于假手術(shù)組（P＜0.05）。（3）GM1組術(shù)后第 1、2 天體質(zhì)量緩慢增加，至第 3、4 天明顯高于模型組（P<0.05），接近假手術(shù)組（P＞0.05），模型組體質(zhì)量增加不明顯。結(jié)論預(yù)防性使用GM1是通過增強(qiáng)大腦皮質(zhì)的Nestin和NGF表達(dá)并延長表達(dá)時間來發(fā)揮其對實(shí)驗(yàn)性腦癱大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

腦性癱瘓；神經(jīng)節(jié)苷脂；神經(jīng)巢蛋白；神經(jīng)生長因子；大鼠

腦性癱瘓簡稱腦癱，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的非進(jìn)行性功能障礙[1]。隨著新生兒醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，新生兒死亡率逐年下降，但腦癱的發(fā)病率反而有升高趨勢，世界范圍內(nèi)大約有1 500萬腦癱患兒，我國發(fā)病率為1.8‰～4‰[2]。腦癱的治療至今仍為世界性醫(yī)學(xué)難題，是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對腦癱的病因?qū)W、病理研究取得了一定進(jìn)展，但治療上并無大的突破，故尋求新的治療腦癱思路、方法、藥物以提高腦癱患兒的生存質(zhì)量并減少由此致兒童殘疾是醫(yī)學(xué)界努力的目標(biāo)。為了解決這一臨床上的難題，不少科研工作者把目光投到腦損傷修復(fù)機(jī)制的研究上。本實(shí)驗(yàn)觀察神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1)對腦癱大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)巢蛋白（Nestin）、神經(jīng)生長因子（Nerve growth factor，NGF）表達(dá)的影響，初步探討藥物干預(yù)對腦損傷大鼠受損神經(jīng)功能修復(fù)的可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用藥物治療腦癱提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)將方法和結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取出生10周并經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d至體質(zhì)量在200～250 g的健康雄性SD大鼠200只（來源于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證書號：SCXK（湘）2011-0003）。適應(yīng)性喂養(yǎng)采用的飼料及屏蔽環(huán)境實(shí)驗(yàn)設(shè)施由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（SPF級）提供，在光/暗周期為12 h/12 h(光照時間7：00-9：00）的條件下飼養(yǎng)于籠中，自由獲得飼料和飲水。

1.1.2 藥物 GM1，商品名“申捷”，北京四環(huán)制藥有限公司生產(chǎn)，藥品批準(zhǔn)文號：H20083224，生產(chǎn)批號：4010531，注射劑，2 mg/mL。

1.1.3 主要儀器和試劑 采用芬蘭352型352017148酶標(biāo)分析儀，芬蘭AC8型洗板機(jī)；NGF酶聯(lián)免疫分析試劑盒、Nestin酶聯(lián)免疫分析試劑盒，均購自北京永輝生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 造模方法按楚勝華等[3]運(yùn)用特制的造模打擊裝置，以自由落體撞擊建立動物腦癱模型。將200只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組60只，GM1組和模型組各70只。大鼠造模前禁食8 h，實(shí)驗(yàn)時將大鼠俯臥位固定于腦立體定向儀上，消毒頭部皮膚，按以10%水合氯醛按0.35 g/kg進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉，正中切開頭皮后剝離骨膜，充分暴露右頂骨，用牙科鉆在冠狀縫后1.5 mm、中線旁2.5 mm處鉆一直徑5 mm的骨窗，并保持硬膜完整。假手術(shù)組：不施加砝碼撞擊即封閉頭皮，未致腦癱；模型組和GM1組：用20 g砝碼于30 cm高處墜落，撞擊撞桿從而撞擊硬膜，致右頂葉中度腦挫裂傷，最后封閉頭皮。術(shù)后蘇醒帶回到原飼養(yǎng)處喂養(yǎng)，并按楚勝華的曠野試驗(yàn)等［3］行為學(xué)測評標(biāo)準(zhǔn)確定腦癱模型的建立。成功后才用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)完成后剩余大鼠一律處死。

1.2.2 給藥方法 假手術(shù)組、模型組均按20 mL/（kg·d） 腹腔注射生理鹽水；GM1組給予濃度為2 mg/mL 的 GM1注射液按 20 mL/（kg·d）腹腔注射，以上各組每天1次，術(shù)前連續(xù)注射3 d。

1.2.3 標(biāo)本采集 造模后在 0、2、4、8、12、16、24 h時間點(diǎn)，分別在各組中提取6只大鼠，以頸動脈取血后處死大鼠，剪斷頭顱，沿正中線切開頭皮，剝開顱骨，暴露完整的大腦組織，撕開硬腦膜后，用彎鑷取出大腦最外層頂葉皮質(zhì)放入標(biāo)記好的冰凍管，置-80℃冰箱保存。所有的標(biāo)本處理好后，分別稱取各份標(biāo)本2 g，加入pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）2 mL中，將標(biāo)本充分研成勻漿，2 000 r/min離心20 min，收集上清液，分裝后冷凍待用。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 Nestin、NGF的檢測 采用芬蘭352型酶標(biāo)分析儀、芬蘭AC8型洗板機(jī)，按NGF酶聯(lián)免疫和Nestin酶聯(lián)免疫分析試劑盒操作使用說明，進(jìn)行兩個指標(biāo)的檢測。即通過包被、加樣、加酶標(biāo)抗體、加底物液顯色、終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上于450 nm波長處，以空白管調(diào)零測定吸光度值。

1.3.2 體質(zhì)量測定 3組大鼠分別于手術(shù)前、術(shù)后第1～4天，各隨機(jī)取10只，采用動物電子天平測定體質(zhì)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠術(shù)后不同時間點(diǎn)大腦皮質(zhì)區(qū)Nestin含量的比較

GM1組0～24 h和模型組 0～12 h大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)Nestin含量明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。GM1組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)的 Nestin 0～12 h含量與模型組比較無顯著差異 （P＞0.05），16～24 h明顯高于模型組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

2.2 各組大鼠不同時間點(diǎn)大腦皮質(zhì)區(qū)NGF含量的比較

GM1組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NGF含量0～24 h均明顯高于模型組（P＜0.05）和假手術(shù)組（P＜0.01）；模型組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)NGF含量僅0、4、8 h高于假手術(shù)組（P＜0.05）。 結(jié)果見表 2。

2.3 各組大鼠不同時間點(diǎn)體質(zhì)量變化的比較

3組大鼠各隨機(jī)取10只，分別于手術(shù)前、術(shù)后第1天至第4天5個時間點(diǎn)測量體質(zhì)量。術(shù)前3組大鼠平均體質(zhì)量無顯著性差異（P＞0.05）；術(shù)后假手術(shù)組體質(zhì)量逐天增加，至第3、4天明顯高于模型組（P＜0.05）；GM1組第 1、2 天體質(zhì)量緩慢增加， 至第3、4天明顯高于模型組（P＜0.05），接近假手術(shù)組。結(jié)果見表3。

3 討論

GM1是一種促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)的藥物，是重要的內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體增強(qiáng)劑，可以增強(qiáng)神經(jīng)營養(yǎng)因子活性，具有促進(jìn)神經(jīng)生長、恢復(fù)神經(jīng)功能等作用[4]。Nestin是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種獨(dú)特的中間絲蛋白[5]，出生后表達(dá)很快降低并消失，僅在少數(shù)保持神經(jīng)發(fā)生功能的部位有表達(dá)。Nestin是反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷最早、快速應(yīng)答的敏感標(biāo)志物之一[6-7]，如缺血性腦損傷早期Nestin即可在損傷最嚴(yán)重的區(qū)域表達(dá)最明顯，并且可誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的原位增殖和神經(jīng)細(xì)胞的再生[8]。NGF也是神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，是神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的生物活性物質(zhì)之一，NGF具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學(xué)功能，對神經(jīng)元的損傷修復(fù)和功能恢復(fù)有重要的調(diào)控作用[9]。

表1 各組大鼠術(shù)后不同時間點(diǎn)大腦皮質(zhì)區(qū)Nestin含量的比較 （±s，ng/L）

表1 各組大鼠術(shù)后不同時間點(diǎn)大腦皮質(zhì)區(qū)Nestin含量的比較 （±s，ng/L）

注：與假手術(shù)組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較△△P＜0.01。下表同。

組 別假手術(shù)組模型組GM1組n 6 6 6 0 h 100.1±2.7 143.3±3.3**142.4±2.6**2 h 109.0±2.6 135.4±4.4**142.3±1.2**4 h 107.5±1.2 130.9±2.6**142.1±3.0**8 h 108.1±7.1 144.6±5.0**141.5±4.6**12 h 115.1±3.2 144.6±2.1**139.4±2.8**16 h 117.8±1.1 114.9±9.9 136.7±2.2**△△24 h 116.6±2.0 115.8±7.3 137.8±4.9**△△

表2 各組大鼠術(shù)后不同時間點(diǎn)大腦皮質(zhì)區(qū)NGF含量的比較 （±s，ng/L）

表2 各組大鼠術(shù)后不同時間點(diǎn)大腦皮質(zhì)區(qū)NGF含量的比較 （±s，ng/L）

組 別假手術(shù)組模型組GM1組n 6 6 6 0 h 188.7±33.7 229.6±27.3*401.1±24.3**△△2 h 201.2±50.3 208.4±6.8 362.2±36.2**△△4 h 193.9±44.6 264.9±43.2*327.7±47.0**△△8 h 209.4±18.6 249.1±27.6*292.2±57.9**△△12 h 219.2±25.7 193.7±31.2 287.5±35.1**△△16 h 205.6±8.6 198.4±9.1 295.2±18.1**△△24 h 218.5±55.2 218.5±25.3 294.3±4.5**△△

表3 各組大鼠術(shù)前及術(shù)后4 d內(nèi)平均體質(zhì)量變化比較 （±s，g）

表3 各組大鼠術(shù)前及術(shù)后4 d內(nèi)平均體質(zhì)量變化比較 （±s，g）

注：與假手術(shù)組和GM1組同時間點(diǎn)比較*P＜0.05。

組 別假手術(shù)組模型組GM1組n 6 6 6術(shù)前230.2±20.1 230.4±25.4 220.5±19.9術(shù)后第1天240.2±13.3 230.6±18.7 230.4±12.0術(shù)后第2天250.0±17.2 230.9±21.0 240.2±12.1術(shù)后第3天260.8±19.8 240.1±19.6*260.6±12.1術(shù)后第4天270.5±18.5 240.6±20.3*270.1±15.9

在設(shè)計本實(shí)驗(yàn)時，我們增加了0 h這個時間點(diǎn)，假手術(shù)組是于大鼠封閉頭皮蘇醒后立即測定為0 h；GM1組與模型組是于大鼠封閉頭皮蘇醒后確定腦癱模型建立，再立即進(jìn)行測定為0 h。其目的是觀察動物手術(shù)或腦癱模型建立后是否快速出現(xiàn)Nestin、NGF的應(yīng)激性表達(dá)增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明確實(shí)如此。腦癱大鼠（包括GM1組和模型組）大腦皮質(zhì)Nestin、NGF表達(dá)0 h即顯著高于假手術(shù)組。0 h以后，GM1組Nestin、NGF表達(dá)明顯高于模型組，這證明了GM1的保護(hù)作用。GM1組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)Nestin表達(dá)0～24 h高于假手術(shù)組，16～24 h高于模型組；NGF表達(dá)0～24 h高于假手術(shù)組和模型組。實(shí)驗(yàn)中GM1組大鼠體質(zhì)量增長明顯高于模型組。這提示大鼠造模前保護(hù)性用藥GM1可降低腦損傷的程度，增加神經(jīng)營養(yǎng)因子Nestin、NGF的表達(dá)，這與諸葛小寅等[10]的研究結(jié)果基本一致。由此看來，預(yù)防性使用藥物GM1可以顯著提高實(shí)驗(yàn)性腦癱大鼠大腦皮質(zhì)Nestin、NGF的表達(dá)和延長表達(dá)時間，這可能是GM1降低了腦癱損傷，起到保護(hù)作用的主要原因。

實(shí)驗(yàn)觀察術(shù)后4 d內(nèi)實(shí)驗(yàn)動物的體質(zhì)量變化情況。GM1組腦癱模型動物術(shù)后第1、2天體質(zhì)量緩慢增長，至術(shù)后第3、4天平均體質(zhì)量增長明顯高于模型組，接近假手術(shù)組。模型組腦癱模型動物體質(zhì)量增長不明顯，術(shù)后第3、4天平均體質(zhì)量明顯低于GM1組和假手術(shù)組。這說明假手術(shù)組動物手術(shù)麻醉后雖打開顱骨，大腦本身卻未受損傷，動物醒后無腦癱，對平時的飲食影響不大，體質(zhì)量每天有所增加。GM1組因?yàn)轭A(yù)防性的使用了GM1，腦癱模型動物的受損程度得到保護(hù)，進(jìn)食影響較少。模型組腦癱后進(jìn)食受阻，每天體質(zhì)量增加不明顯，且因體質(zhì)衰弱，死亡較多，這與鄭修元等[8]的研究相似，本實(shí)驗(yàn)中各組死亡率比較已有論文發(fā)表[11]。由此推測，GM1對實(shí)驗(yàn)性腦癱大鼠可能起到了保護(hù)作用。

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（本文編輯 徐愛良）

Sdudy Ganglioside on Expression of Nestin and NGF in Cerebral Palsy Cerebral Cortex

JIN Ling,HE Xiaojin,YIN Lingtao,JIANG Xinglin*
（Department of Diagnosis,Huaihua Medical College,Huaihua,Hunan 418000,China）

ObjectiveTo observe the ganglion monoglyceride(GM1)body weight of rats in cerebral palsy and brain cortex Nestin(Nestin),nerve growth factor(NGF)expression,and to explore GM1may promote nerve repair mechanisms of cerebral palsy.Methods10 weeks birth of 200 male SD ratswere randomly divided into three groups:sham group 60-no cerebral palsy,cerebral palsy model 140,divided into model group 70,intraperitoneal injection of saline,the GM1group 70,intraperitoneal injection GM1.Nestin and NGF expressions of cerebral cortex Nestin in rats were detected by immunohistochemistry at 7 time points of the postoperative 0～24 h periods.The total weight of experimental animals was observed during preoperative and postoperative 1～4 days.Results① The GM1group 0～24 h,the model group 0～12 h Nestin expression in ratcerebralcortex wassignificantly higherthan the sham group(P＜0.01);GM1group 16～24h Nestin expression in rat cerebral cortex was significantly higher than the model group(P＜0.01). ② The GM1group 0～24 h NGF expression in rat cerebral cortex was significantly higher than the model group(P＜0.05)and the sham group(P＜0.01).Model rat cerebral cortex expression of NGF only at 0,4,8 h higher than the sham group(P＜0.05).③GM1group after the first 2 days of weight increased slowly,while the weight after 3 or 4 days was significantly higher(P＜0.05),close to the sham group(P＞0.05).Model group,the weight was not significant.ConclusionGM1was used preventability and its neuroprotective effects on experimental rat cerebral cortex of the brain were improved by enhancing Nestin and NGF expression.

cerebral palsy;GM1;Nestin;NGF;Rat

R651.1，R969

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2014.08.004.013.04

2014-03-03

湖南省科技廳科技計劃項目（2009FJ3200）；湖南省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目（2012124）。

金 玲，女，碩士，副教授，主要從事心腦血管系統(tǒng)疾病的防治和研究工作。

* 江興林，男，教授，E-mail：jxlin6@163.com。

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