黃一江，鄭明剛，孫中濤，鄭 立，王 玲，楊佰娟

（1．山東農業(yè)大學 生命科學學院，山東 泰安 271018；2．國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061；3．青島大學 化學化工與環(huán)境學院，山東 青島 266071）

不飽和脂肪酸（Unsaturated Fatty Acids，UFAs）廣泛存在于動植物中，在一些藻類中的質量濃度尤其豐富［1］。有研究表明UFAs對治療心血管疾病、癌癥、風濕性關節(jié)炎等病癥有著重要作用［2－5］。因此，人們越來越關注UFAs在制藥和保健品中的應用。當前，許多重要的UFAs產自深海魚油，而魚類通過食用微藻來積累UFAs［6］。隨著環(huán)境的污染，捕魚業(yè)已經無法滿足人們對UFAs日益增長的需求［7－8］。故研究海洋微藻中的UFAs，對緩解當前社會中UFAs的需求壓力有著極其重要的意義。目前，微藻中不飽和脂肪酸的低提取量是限制其發(fā)展與應用的一大難題。因而，通過分子生物學手段來提高微藻中UFAs的質量濃度，為解決這一難題提供了新的思路。然而微藻中UFAs的合成受許多基因的調控，故研究這些基因的表達與UFAs合成的關系成為目前首要任務。

硬脂酰輔酶A去飽和酶（stearoyl－coenzyme A desaturase，SCD）在催化飽和脂肪酸形成不飽和脂肪酸的途徑中起著重要的作用。它是催化飽和脂肪酸第9位碳鏈形成n－9系不飽和脂肪酸的關鍵酶，其催化底物主要以棕櫚酸（C16∶0）和硬脂酸（C18∶0）為主［9］。該基因的表達與不飽和脂肪酸的合成有著密切的關系。該基因已經從大鼠、小鼠、牛、人類以及倉鼠中克隆獲得。目前，對該基因的研究主要存在于動物體中。在微藻中對SCD基因的研究主要集中在該基因的克隆與結構的分析以及該基因在脂肪酸合成代謝中的作用機制，然而在轉錄水平上揭示SCD基因與不飽和脂肪酸合成關系的報道尚未發(fā)現(xiàn)。有研究表明當基因的表達量增加時，其所催化合成的代謝產物的質量濃度也隨之增加［10－11］。因此，研究SCD基因表達差異對探明不飽和脂肪酸合成的分子機制有重大意義。

本研究測定了不同的溫度和N、Fe3＋質量濃度對微擬球藻脂肪酸組成以及SCD基因表達的影響。實驗結果將有助于進一步揭示SCD基因表達與微擬球藻不飽和脂肪酸合成之間的關系。同時為日后利用海洋微藻生產不飽和脂肪酸打下了理論基礎。

1 材料與方法

1．1 微藻培養(yǎng)及總RNA提取

實驗選用國家海洋局第一海洋研究所藻種庫的微擬球藻藻種（NannochloropsisgaditanaHH－1）。將微擬球藻接入f／2培養(yǎng)基中，在溫度為25℃，光照強度7 000lx的條件下培養(yǎng)［12］。培養(yǎng)至指數(shù)后期，離心收集藻體（4℃、5 000rpm、5min），并接種到新的f／2培養(yǎng)基中，分別在不同溫度和N、Fe3＋質量濃度的條件下對其進行處理，分別設置條件如下：15℃（低溫）、25℃（對照）、35℃（高溫），0mg／L NaNO3（缺 N）、75mg／L NaNO3（對照）、150mg／L NaNO3（富N），0mg／L FeCl3（缺Fe）、3．159mg／L FeCl3（對照）、6mg／L FeCl3（富Fe）。當微擬球球藻細胞密度達到7×108cell／mL時，離心（4℃，4 000rpm，5min）收集，保存于液氮中。

用Trizol Reagent提取總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。利用TransScript First－Strand cDNA Synthesis SuperMix Kit（TransGen公司，中國北京）對RNA進行反轉錄，合成cDNA。

1．2 SCD基因的表達分析

以本實驗室獲得的轉錄組數(shù)據(jù)庫為基礎，設計SCD基因的熒光定量引物（前引物：5′－TTGTGGGCTCATCGTTCCTA－3′，后引物：5′－AACATCACTGTGCCATCCTG－3′）。 根據(jù)TransStartTMTop Green qPCR SuperMix Kit說明，設置qRT－PCR的反應條件：94℃3min；94℃15s，55℃15s，72℃34s，40個循環(huán)。以微擬球藻的actin和18SrRNA基因作雙內參。

1．3 脂肪酸組成分析

脂肪酸甲脂化：稱取1g的油脂，加入鹽酸－甲醇溶液（V（HC）∶V（CH3OH）＝1∶9）4．0mL，混勻，充N2保護，在60℃水浴環(huán)境下甲酯化20min，甲酯化過程中每隔10min震蕩一次，甲酯化后的樣品冷卻后加入飽和氯化鈉3．0mL，正己烷1．0mL，充分震蕩，靜置，取正己烷層用無水硫酸鈉脫水后進行色譜分析。

脂肪酸組成分析：采用美國Aglient 7890AGC system氣相色譜儀（氫火焰離子化檢測器（FID）和HP－5毛細管柱（規(guī)格）），程序升溫以10℃／min從50℃初溫升到280℃。進樣口溫度為270℃，載氣為高純度氦，流速1mL／min。采用無分流進樣，進樣量為1μL，以面積歸一化法計算脂肪酸組分的相對含量。

1．4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS軟件對所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，以P＜0．05作為差異顯著性水平，以P＜0．01作為差異極顯著性水平。采用Duncan多重比較法對平均值進行多重比較。

2 結 果

2．1 不同N質量濃度對微擬球藻脂肪酸組成的影響

由圖1可見，不同的N質量濃度對脂肪酸組成有著顯著的影響。相比于對照組，在缺N處理下，微擬球藻中C14∶0占總脂肪酸的比例有顯著提高，提高了44．48%，而C18∶2、C18∶1、C20∶4占總脂肪酸的比例則有明顯的降低趨勢，降幅分別為18．18%、6．11%和22．51%。在富N處理組中，C18∶2、C20∶4和C20∶5在微擬球藻總脂肪酸中的比例明顯提高，分別提高了9．91%、9．12%和21．46%。而C16∶0和C18∶0占總脂肪酸的比例分別降低了8．52%和29．81%。這表明富N可以促進多不飽和脂肪酸的形成，而缺N條件更有利于飽和脂肪酸的合成。

圖1 不同N質量濃度下微擬球藻幾種主要脂肪酸的組成Fig．1 Major fatty acids composition in Nannochloropsis gaditana under different nitrogen concentrations

2．2 不同培養(yǎng)溫度對微擬球藻脂肪酸組成的影響

由圖2可見，相比于對照組，在高溫處理條件下，微擬球藻中C16∶1和C18∶1占總脂肪酸的比例有顯著提高，分別提高了8%和70．81%，而C20∶4和C20∶5占總脂肪酸的比例則明顯降低，降幅分別為17．09%和19．41%。在低溫處理組中，C18∶2和C20∶4在微擬球藻總脂肪酸中的比例明顯提高，分別提高了35．54%和15．67%。而C20∶5占總脂肪酸的比例降低了12．69%。這些結果表明高溫可以促進單不飽和脂肪酸的積累，而低溫更有利于多不飽和脂肪酸的積累。

圖2 不同溫度下微擬球藻幾種主要脂肪酸的組成Fig．2 Major fatty acids composition in Nannochloropsis gaditana at different temperatures

2．3 不同F(xiàn)e3＋質量濃度對微擬球藻脂肪酸組成的影響

由圖3可見，與對照組比較，在缺Fe的處理組中，C14∶0和C16∶1在微擬球藻總脂肪酸中的比例明顯提高，分別提高了5．83%和4．59%，而C16∶0、C18∶1、C18∶0和C20∶5在總脂肪酸的比例顯著降低，降幅分別是15．25%、12．89%、40．37%和15．05%。在富Fe的處理組中，C18∶2、C20∶4和C20∶5在微擬球藻總脂肪酸中的比例明顯提高，分別提高了8．26%、14．81%和40．75%。而C16∶0和C18∶0在總脂肪酸的比例顯著降低，降幅分別是3．66%和40．99%。結果表明，隨著Fe3＋質量濃度的增加，不飽和脂肪酸尤其是C20∶4和C20∶5發(fā)生積累。

圖3 不同F(xiàn)e3＋質量濃度下微擬球藻幾種主要脂肪酸的組成Fig．3 Major fatty acids composition in Nannochloropsis gaditana under different Fe concentrations

2．4 不同條件對SCD基因表達的影響

利用實時熒光定量技術對微擬球藻在缺N、富N、低溫、高溫、缺Fe和富Fe條件處理下，SCD基因的表達差異進行了分析。結果表明：在富N、低溫、高溫以及富Fe的條件下，SCD基因的表達量比對照要高，其中，富N、高溫和富Fe條件下SCD基因的表達量約為對照的15倍。而在缺N和缺Fe條件下SCD基因的表達量要低于對照（圖4）。

圖4 不同處理條件下SCD基因的表達差異Fig．4 Differential expression of SCD gene in Nannochloropsis gaditana under different treatments

3 結 論

藻類的脂肪酸組成受多種環(huán)境因素的影響。培養(yǎng)基中N的水平、培養(yǎng)溫度以及Fe3＋質量濃度都是影響微藻脂肪酸組成的重要因素。不同溫度和N、Fe3＋質量濃度對單細胞藻類的脂肪酸組成影響較大。Yongmanitchai［13］發(fā)現(xiàn)，在高質量濃度的N處理條件下，小球藻（Chlorellasp．）、柵藻（Scenedesmussp．）和三角褐指藻（PhaeodactylttmtricornutumBohlin）的多不飽和脂肪酸質量濃度會顯著增加［13］。有研究者指出，當處于缺N條件時，微藻細胞能夠選擇性地優(yōu)先利用一種或多種含氮大分子，使細胞內的含氮物質（如蛋白質等）的質量濃度下降，而使細胞內的碳水化合物（如多糖及脂肪酸等）的質量濃度升高［14］。Converti等［15］發(fā)現(xiàn)，當溫度從20℃升高至25℃時，微擬球藻脂肪酸質量濃度會增加一倍［15］。有研究表明高質量濃度的Fe3＋可以促進總脂的積累，并且可以促進魚類組織中長鏈多不飽和脂肪酸的合成［16］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在缺N的條件下，微擬球藻中的飽和脂肪酸的比例顯著提高，尤其是C14∶0，占總脂肪酸的比例提高了44．48%，而C18∶2、C18∶1、C20∶4則有明顯的降低趨勢，降幅分別為18．18%、6．11%和22．51%。這與之前研究三角褐指藻在N限制的培養(yǎng)條件下，多不飽和脂肪酸在總脂肪中的質量濃度下降的結果相符。在富N條件下C18∶2、C20∶4和C20∶5在微擬球藻總脂肪酸中的比例明顯提高，分別提高了9．91%、9．12%和21．46%。在高溫處理下，微擬球藻中C16∶1和C18∶1占總脂肪酸的比例有顯著提高，分別提高了8%和70．81%。而C20∶4和C20∶5則有明顯的降低趨勢，降幅分別為17．09%和19．41%。在低溫處理組中，C18∶2和C20∶4在微擬球藻總脂肪酸中的比例明顯提高，分別提高了35．54%和15．67%。在富Fe條件下，多不飽和脂肪酸尤其是C20∶4和C20∶5發(fā)生積累。這表明富N、低溫、高溫以及富Fe可以使微擬球藻的不飽和脂肪酸增加，而缺N以及缺Fe則使得細胞內不飽和脂肪酸的質量濃度有所下降。N是許多酶的組成要素，同時也是微藻生長所不可或缺的營養(yǎng)要素，因此缺N的條件下不僅會影響微藻的生長同時也限制了如脂肪酸去飽和酶等一系列酶的合成，故而引起了不飽和脂肪酸質量濃度下降。而Fe則是許多脂肪酸去飽和酶的輔助因子，是這些酶發(fā)揮活性所必需的，缺Fe將使得這些酶的活性喪失從而導致不飽和脂肪酸的質量濃度下降。有研究表明，植物在低溫環(huán)境下會產生不飽和脂肪酸以減小低溫對其的傷害，而較高的溫度則可以適當增加酶的活性，從而使體內不飽和脂肪酸質量濃度增加。

不飽和脂肪酸是由飽和脂肪酸經過去飽和酶的催化引入雙鍵而形成的。不飽和脂肪酸的質量濃度多少與去飽和酶密切相關。有研究表明代謝物的質量濃度與合成該代謝物的相關基因的表達量呈正相關。SCD是催化飽和脂肪酸形成第一個雙鍵的關鍵酶［17］。因此，為了從分子水平上揭示脂肪酸變化的原因，我們通過熒光定量技術檢測了在不同溫度和N、Fe3＋質量濃度的條件下，微擬球藻SCD基因的表達情況。結果表明，富N、低溫、高溫以及富Fe使SCD基因的表達上調，而缺N和缺Fe則會抑制SCD基因的表達。結合GC－MS所測得的脂肪酸數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：當微擬球藻中不飽和脂肪酸質量濃度升高時SCD基因的表達也隨之升高。二者之間呈現(xiàn)出顯著的正相關。這一結果從某種程度上論證了，不飽和脂肪酸質量濃度升高的原因是不同的處理條件使得SCD基因的表達上調，從而增加了微擬球藻中SCD的質量濃度，進而催化了飽和脂肪酸形成雙鍵。本實驗揭示了SCD基因在不飽和脂肪酸合成途徑中的重要作用，然而脂肪酸代謝是由多個基因共同調控的，因此更多的與不飽和脂肪酸合成相關的基因有待于進一步研究。

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