王 林，李 波，耿智敏#，徐之超，陳 晨，李文智，鄭見寶

1)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科 西安 710061 2)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普通外科 西安 710061

肝纖維化系指肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellualr matrix，ECM)過度增生與異常沉積，最終導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能異常的病理變化，進(jìn)而發(fā)展為肝硬變[1]。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的持續(xù)激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制HSC活化、增殖成為目前阻斷、逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要策略。索拉菲尼作為一種多靶點(diǎn)、多激酶抑制劑靶向治療藥物，能明顯抑制HCC細(xì)胞增殖及血管新生[2]，但其對 HSC有無作用，此方面研究較少。該研究通過體外實(shí)驗(yàn)觀察索拉菲尼對HSC活性及活化狀態(tài)的影響，為索拉菲尼治療肝纖維化提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人HSC細(xì)胞系(LX2)購自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室;索拉菲尼由拜耳公司饋贈(zèng)，劑型200 mg/片，用體積分?jǐn)?shù)100%DMSO溶解，－20℃保存。α-SMA兔抗人單抗購自美國Abcam公司，β-actin兔抗人單抗購自北京博奧森公司，ERK1/2兔抗人單抗、p-ERK1/2兔抗人單抗、AKT羊抗人單抗、p-AKT羊抗人單抗、兔抗羊二抗、羊抗兔二抗等購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。TGF-β1和PDGF-BB ELISA檢測試劑盒購自美國R＆D公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) LX2細(xì)胞在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法測定索拉菲尼對LX2細(xì)胞的增殖抑制率 取LX2細(xì)胞，以5×104孔－1的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后加入索拉菲尼，藥物濃度分別為0(對照)、1、2、5、10、20、50 μmol/L，每種濃度設(shè) 3個(gè)復(fù)孔。加藥后分別培養(yǎng)12、24、36、48 h，然后每孔加MTT(5 g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去原培養(yǎng)液，加入 DMSO 150 μL/孔，振蕩 10 min，用酶標(biāo)儀(波長490 nm)測定每孔的A值，增殖抑制率=(對照組A值－實(shí)驗(yàn)組A值)/對照組A值×100%。

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測LX2細(xì)胞α-SMA的表達(dá) ①細(xì)胞爬片:取LX2細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為(1～5)×105mL－1。移液器吸取細(xì)胞懸液500 μL，分別接種于5組蓋玻片上。培養(yǎng)箱孵育4 h，移液器輕輕移去培養(yǎng)液，對照組加1 mL培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入1 mL 含1、2、5、10 μmol/L 索拉菲尼的培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。②免疫細(xì)胞化學(xué)染色:40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2封閉10 min，PBS洗3遍，山羊血清封閉(室溫下1 h)，甩去山羊血清，加入α-SMA一抗，4℃冰箱過夜。PBS洗3遍，加ABC復(fù)合物，室溫下30 min～1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，自然風(fēng)干后，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察α-SMA表達(dá)情況，并于400倍鏡下選取6個(gè)視野進(jìn)行計(jì)分。陽性細(xì)胞百分比計(jì)分:按照陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例計(jì)分，0、＜25%、25% ～、50% ～、75% ～分別為0、1、2、3、4 分。著色強(qiáng)度計(jì)分:細(xì)胞無著色，0分;淺黃色，1分;棕黃色，2分;棕褐色，3分。2項(xiàng)評分結(jié)果相加，0分為陰性(－)，1～分為弱陽性(+)，4～分為中等陽性(?)，6～7分為強(qiáng)陽性(?)。各組分別設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。

1.5 ELISA 法檢測 TGF-β1和 PDGF-BB 實(shí)驗(yàn)組使用含1、2、5、10 μmol/L 索拉菲尼的培養(yǎng)液，對照組用未加索拉菲尼的單純培養(yǎng)液。分別干預(yù)LX2細(xì)胞12、24、36 h后，提取上清，使用 ELISA試劑盒檢測上清中TGF-β1和PDGF-BB的水平。各組分別設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

1.6 Western blot檢測 AKT/p-AKT 和 ERK1、ERK2/p-ERK1、p-ERK2取LX2細(xì)胞，培養(yǎng)液分別為未添加索拉菲尼和含索拉菲尼1、2、5、10 μmol/L的培養(yǎng)液。培養(yǎng)0.5 h后，倒棄培養(yǎng)液，添加400 μL裂解液，置于冰盒上1 h，離心提取蛋白，蛋白定量后上樣20 μL，行Western blot檢測各組不同蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)內(nèi)參為β-actin。每組重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用析因設(shè)計(jì)的方差分析比較各組LX2細(xì)胞增殖抑制率、上清 TGF-β1和PDGF-BB水平的差異，各組α-SMA表達(dá)情況的比較采用Kruskual-Wallis多組等級資料的秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 索拉菲尼對LX2細(xì)胞增殖能力的影響 結(jié)果見表1。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測LX2細(xì)胞α-SMA的表達(dá) 對照組均有α-SMA表達(dá)，1、2、5 μmol/L實(shí)驗(yàn)組均有α-SMA表達(dá)，但10 μmol/L組幾乎無正常形態(tài)細(xì)胞，α-SMA表達(dá)也明顯減弱。見圖1和表2。

2.3 ELISA 法檢測 TGF-β1與 PDGF-BB 結(jié)果見表 3、4。

表1 各組LX2細(xì)胞的增殖抑制率比較(n=3) %

圖1 索拉菲尼作用24 h后LX2細(xì)胞α-SMA表達(dá)情況(SABC，×100)

表2 各組LX2細(xì)胞α-SMA表達(dá)情況(n=24)視野

表3 各組上清TGF-β1水平(n=5) μg/L

表4 各組上清PDGF-BB水平(n=5) ng/L

2.4 Western blot檢測結(jié)果 見圖2?？芍鹘MERK1、ERK2、AKT 蛋白表達(dá)量基本相同，10 μmol/L組 p-AKT、p-ERK1、p-ERK2蛋白表達(dá)降低。

圖2 各組AKT/p-AKT和ERK1、ERK2/p-ERK1、p-ERK2蛋白表達(dá)情況

3 討論

索拉菲尼屬于分子靶向治療新藥，是一種多靶點(diǎn)、多激酶抑制劑，在抑制肝癌細(xì)胞方面已取得重大進(jìn)展。其作用機(jī)制主要為2個(gè)方面[2-3]:①通過阻斷MAPK通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖。②通過阻斷VEGF受體和PDGF受體，抑制腫瘤血管生成。近年來研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，索拉菲尼除了可抑制上皮癌細(xì)胞的增殖外，還可調(diào)節(jié)鄰近間質(zhì)細(xì)胞的受體酪氨酸激酶信號(hào)通路。

活化的HSC是肝纖維化發(fā)生時(shí)ECM的主要來源[6]。已有研究[7]表明，索拉菲尼用于門靜脈高壓癥可顯著改善血流動(dòng)力學(xué)、抑制新生血管形成、減輕肝臟的纖維化，明顯降低門靜脈壓力。索拉菲尼是否可以抑制HSC的活性及活化，繼而阻斷、逆轉(zhuǎn)肝纖維化，該實(shí)驗(yàn)對此進(jìn)行了研究。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，索拉菲尼可抑制LX2細(xì)胞活性，還發(fā)現(xiàn)藥物濃度越高索拉菲尼的抑制作用越明顯，且隨著時(shí)間的延長索拉菲尼的抑制作用表現(xiàn)得也越明顯。但在48 h時(shí)，LX2細(xì)胞活性有所恢復(fù)，考慮與索拉菲尼藥代動(dòng)力學(xué)因素有關(guān)。故隨后實(shí)驗(yàn)作者選用的藥物濃度為 1、2、5 和 10 μmol/L，作用時(shí)間為12、24 和36 h。

實(shí)驗(yàn)中以不同濃度索拉菲尼干預(yù)LX2細(xì)胞12、24和36 h后，發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制表現(xiàn)為以下幾方面:①索拉菲尼抑制LX2細(xì)胞的活化，而α-SMA的表達(dá)為HSC活化的標(biāo)志，活化的HSC是肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測α-SMA的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，對照組和實(shí)驗(yàn)組中α-SMA的表達(dá)有差異，證明索拉菲尼可抑制LX2細(xì)胞活化。②索拉菲尼可抑制LX2細(xì)胞分泌某些細(xì)胞活性因子，包括PDGF-BB和TGF-β1。細(xì)胞因子分泌作為HSC活化重要特征之一，主要表現(xiàn)在TGF-β1、PDGF-BB等大量分泌。該實(shí)驗(yàn)通過ELISA法檢測不同水平索拉菲尼干預(yù)下提取的LX2細(xì)胞上清中PDGF-BB、TGF-β1的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，隨著藥物水平的升高，PDGF-BB和TGF-β1在上清中的水平呈遞減趨勢，而同一藥物水平下，隨著時(shí)間的延長，PDGF-BB和TGF-β1也呈遞減表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到抑制LX2細(xì)胞活化的目的。③索拉菲尼通過抑制LX2細(xì)胞的PDGF信號(hào)通路，從而抑制其活化。該實(shí)驗(yàn)通過Western blot方法檢測Ras/ERK通路中ERK1/ERK2和p-ERK1/p-ERK2以及PI3K通路中AKT和p-AKT的變化，可評估索拉菲尼對PDGF信號(hào)通路的影響。作者發(fā)現(xiàn)對照組和實(shí)驗(yàn)組ERK1/ERK2及AKT表達(dá)水平基本相同，而其相應(yīng)的磷酸化狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)逐漸減弱，說明索拉菲尼可抑制PDGF信號(hào)通路中ERK1/ERK2及AKT的磷酸化，阻斷了PDGF細(xì)胞通路的正常傳導(dǎo)，從而抑制LX2細(xì)胞的活化、增殖。

綜上，該研究初步證實(shí)索拉菲尼可下調(diào)HSC上清液中PDGF-BB和TGF-β1的分泌，抑制 PDGF信號(hào)通路，最終抑制HSC的活化及活性，為索拉菲尼治療肝纖維化提供了新的理論依據(jù)。

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