王小龍，馮斐斐，孫鵬輝，李 杰，陸?zhàn)┤I菡雅，徐小艷，姚 武，周 舫#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001 2)漯河市疾病預(yù)防控制中心應(yīng)急辦公室 漯河 462300 3)廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境衛(wèi)生與地方病防制所 南寧 530028

肺癌是目前對(duì)人類危害最大的惡性腫瘤。近幾十年來(lái)，其發(fā)病率和病死率都急劇上升，居世界癌癥死因之首。目前，肺癌的治療仍然以放化療為主，關(guān)于肺癌治療的研究也多集中于此。然而隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來(lái)不斷有新的肺癌療法出現(xiàn)，如免疫療法、基因療法等[1]。熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是熱休克蛋白家族的一個(gè)重要成員，它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。有研究[3]證實(shí)，HSP70在腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的氨基末端激酶(jun N-terminal kinase，JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)參與調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程，而Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者[4-6]。作者采用放線菌素D(actinomycin D，Act D)誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞凋亡，分別用熱處理、JNK和p38 MAPK通路抑制劑作用于Act D誘導(dǎo)過(guò)的A549細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中HSP70、磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化p38(p-p38)和Caspase-3的表達(dá)水平，探討 HSP70、JNK和 p38在 Act D誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 A549細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞生物研究所提供。蛋白抽提試劑盒，eECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，Act D(北京Solarbio公司)，Accuri C6流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，Nanovue plus微量蛋白核酸測(cè)定儀(美國(guó)GE公司)。

1.2 Act D染毒劑量的MTT法確定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔200 μL，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2環(huán)境下孵育至鋪滿孔底。分別加入終質(zhì)量濃度為 0、5、10、20、40、60、80、160 mg/L 的Act D，每組設(shè)5個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，加入20 μL的MTT(5 g/L)染液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，每孔加入 100 μL DMSO，室溫?fù)u晃 10 min，在 492 nm處檢測(cè)吸光度，計(jì)算細(xì)胞致死率，根據(jù)MTT的結(jié)果選定所用的染毒濃度。

1.3 各組細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 采用Act D作為染毒物，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分為DMSO對(duì)照組(A組)、Act D染毒組(B組)、熱處理(42℃，30 min)+Act D組(C組)、JNK抑制劑SP600125+Act D組(D組)和p38 MAPK抑制劑SB203580+Act D組(E組)5組。各組細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，重懸，1000 r/min離心10 min，使用工作液200 μL重懸細(xì)胞于1.5 mL的EP管中，然后向各管中分別加入Annexin V-FITC 5 μL和碘化丙啶5 μL，混勻后避光反應(yīng)10 min上機(jī)檢測(cè)。每組均設(shè)6個(gè)平行對(duì)照。

1.4 各組細(xì)胞中蛋白含量的Western blot法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.3。使用蛋白抽提試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白，使用Nanovue plus微量蛋白核酸測(cè)定儀測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整濃度，確保每孔上樣量均為50 μg。將蛋白樣品和上樣緩沖液按比例混勻，100℃，5 min變性。與標(biāo)準(zhǔn)分子蛋白Marker同時(shí)上樣，電泳條件為80 V 40 min，120 V 90 min。電泳結(jié)束后切膠，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用50 g/L的脫脂牛奶封閉2 h，使用TBST溶液洗脫3次，10 min/次，然后用一抗(抗體均購(gòu)自北京博奧森生物公司，按1∶500稀釋)4℃孵育過(guò)夜，二抗(按1∶2000稀釋)常溫孵育3 h以上，洗脫3次后，在暗室中進(jìn)行eECL顯影。用圖像分析軟件Quantity one分析條帶的積分光密度。每組均設(shè)3個(gè)平行對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0進(jìn)行分析。應(yīng)用方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組細(xì)胞凋亡率、HSP70、p-JNK、p-p38以及Caspase-3表達(dá)水平的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)染毒劑量的MTT法確定 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著Act D濃度的提高，A549細(xì)胞的致死率逐漸上升，Act D對(duì)A549細(xì)胞的半數(shù)致死濃度大約為75 mg/L，該實(shí)驗(yàn)選用20 mg/L作為染毒劑量。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率以及 HSP70、p-JNK、p-p38和Caspase-3的表達(dá)水平 見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組細(xì)胞凋亡率以及HSP70、p-JNK、p-p38和Caspase-3的表達(dá)水平

圖1 Western blot檢測(cè)HSP70、p-JNK、p-p38和Caspase-3表達(dá)水平

3 討論

HSP70可由多種因素誘導(dǎo)產(chǎn)生，如應(yīng)激、藥物、腫瘤等。JNK和p38 MAPK作為MAPK超家族的重要成員，對(duì)細(xì)胞生存具有重要意義[4]。研究[7-9]證實(shí)，HSP70參與調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程，且該過(guò)程很可能與JNK和p38 MAPK通路有關(guān)。

為探討HSP70、JNK和p38 MAPK在Act D誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡中的作用，作者分別采用熱處理、JNK抑制劑SP600125和p38 MAPK抑制劑SB203580處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Act D組相比，以上3個(gè)處理組的細(xì)胞凋亡率明顯下降。Western blot結(jié)果也進(jìn)一步證明，經(jīng)過(guò)Act D處理的A549細(xì)胞HSP70表達(dá)增加，而熱處理、SP600125和SB203580能夠降低Act D對(duì)A549細(xì)胞的作用效果，說(shuō)明HSP70可能通過(guò)JNK和p38 MAPK通路來(lái)抑制細(xì)胞的凋亡過(guò)程。Gong等[9]研究發(fā)現(xiàn)，HSP70可能與MK2的磷酸化有關(guān)，而MK2參與了p38 MAPK通路磷酸化。由此可見(jiàn)，HSP70參與了細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程，而這一過(guò)程涉及JNK或p38 MAPK的激活。徐勇等[10]用JNK和p38抑制劑作用于Jurkat細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)2種抑制劑能夠降低藤黃酸誘導(dǎo)的Caspase-3水平。

然而細(xì)胞凋亡涉及多個(gè)通路，目前已知的有線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路等[11]。HSP70可能同時(shí)與多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路共同參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，具體的機(jī)制還需進(jìn)一步研究予以證實(shí)。

[1]Hall RD，Gray JE，Chiappori AA.Beyond the standard ofcare:a review of novel immunotherapy trials for the treatment of lung cancer[J].Cancer Control，2013，20(1):22

[2]孫鵬輝，梁守沛，陸?zhàn)┤?，?肺癌組織熱休克蛋白70提取物對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2012，47(5):608

[3]邵國(guó)益，劉青光.熱休克蛋白70反義寡核苷酸聯(lián)合化療藥物抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖的實(shí)驗(yàn)研究[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2012，33(3):384

[4]白蕓，龍啟福.MAPK在細(xì)胞凋亡中的研究進(jìn)展[J].微量元素與健康研究，2011，28(3):58

[5]傅應(yīng)亞，黎友倫.JNK信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，39(3):281

[6]徐艷清.p38MAPK在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013，29(20):3090

[7]Wang X，Jiang Q，Wang W，et al.Molecular mechanism of polypeptides from Chlamys farreri(PCF)＇s anti-apoptotic effect in UVA-exposed HaCaT cellsinvolvesHSF1/HSP70，JNK，XO，iNOS and NO/ROS[J].J Photochem Photobiol B，2014，130:47

[8]王曉雯，王春波，李丙華，等.HSF1/HSP70通路抑制c-Jun氨基末端激酶的活化保護(hù)UVA誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡[J].衛(wèi)生研究，2012，41(1):40

[9]Gong X，Luo T，Deng P，et al.Stress-induced interaction between p38 MAPK and HSP70[J].Biochem Biophys Res Commun，2012，425(2):357

[10]徐勇，歐陽(yáng)建，張啟國(guó)，等.藤黃酸通過(guò)MAPK通路誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的機(jī)理[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2012，20(3):587

[11]趙彥超，顧耘.細(xì)胞凋亡通路研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2013，41(4):285