張瑞濤，史惠蓉，任 芳，陳志敏，賈艷艷，馮 巍

鄭州大學第一附屬醫(yī)院婦科 鄭州 450052

人組織激肽釋放酶(kallikrein-related peptidase，KLK)家族包含15種結構同源的絲氨酸激酶，其基因定位于染色體19q13.4，在調(diào)節(jié)細胞生長和組織重構等一系列生理過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。KLK14又稱類組織激肽釋放酶6，具有胰島素樣和糜蛋白酶樣雙重作用，能降解膠原Ⅳ等細胞外基質(zhì)，可能與腫瘤的生長、轉移和浸潤等有關[3]。研究[4]表明，KLK14在卵巢癌和乳癌等多種上皮性腫瘤組織中異常高表達。作者采用RNA干擾技術抑制KLK14在人卵巢癌OVCAR-3細胞中的表達，觀察其對細胞凋亡和遷移的影響，初步探討KLK14與卵巢癌細胞惡性生物學行為的關系及可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 人卵巢癌 SK-OV-3、OVCAR-3和HO-8910細胞系購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，預實驗中已證實KLK14基因和蛋白在OVCAR-3細胞中的表達均高于SK-OV-3和 HO-8910細胞，故選用OVCAR-3細胞為后續(xù)實驗細胞。Trizol購自美國Invitrogen公司。cDNA第一鏈合成試劑盒為加拿大Fermentas公司產(chǎn)品，2×Taq Master Mix為上海萊楓生物公司產(chǎn)品。應用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物序列，交上海生物工程公司合成。TUNEL試劑盒購自德國Roche公司，8 μm Transwell小室購自美國Millipore公司。KLK14 shRNA質(zhì)粒、control shRNA質(zhì)粒、Transfection Reagent、山羊抗人KLK14多克隆抗體、鼠抗人MMP2單克隆抗體和鼠抗人MMP9單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。鼠抗人β-actin、鼠抗人Caspase-3和鼠抗人Caspase-9單克隆抗體、IP及WB蛋白提取液、ECL發(fā)光試劑盒均購自江蘇碧云天公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉染 OVCAR-3細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。按照Transfection Reagent說明書進行細胞轉染:轉染前1 d，換取不含抗生素的新鮮培養(yǎng)基后調(diào)整OVCAR-3細胞密度為2×105mL－1，以每孔2 mL接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，待細胞50% ～70%融合時，分為3組，實驗組和對照組更換為新鮮配制的含KLK14 shRNA或?qū)φ誷hRNA的無抗生素、無血清培養(yǎng)基，空白組僅加入同種培養(yǎng)基。孵育6 h后加入體積分數(shù)20%的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h后用于后續(xù)實驗。

1.3 RT-PCR Trizol提取細胞總 RNA，逆轉錄為cDNA。KLK14上游引物 5'-ACGCACCCCAACTA CAACTC-3'，下游引物 5'-GAACTCCTGCACAGAC CATG-3'(283 bp);β-actin上游引物 5'-ACGCAC CCCAACTACAACTC-3'，下游引物 5'-TCTCCTTAAT GTCACGCACGA-3'(372 bp)。PCR反應體系:模板cDNA 1 μL，2 × Taq Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各 1 μL，無 RNase H2O 定容至 25 μL。RT-PCR反應條件:94℃預變性3 min;94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán);72℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物行20 g/L瓊脂糖凝膠(混有EB)電泳，Image-Pro Plus 6.0系統(tǒng)采集、分析圖像，以KLK14/β-actin比值表示目的基因的相對表達量，實驗重復3次。

1.4 TUNEL實驗 在載玻片上滴加單細胞懸液，培養(yǎng)4～6 h至細胞貼壁后，以40 g/L多聚甲醛固定30 min，體積分數(shù)0.3%過氧化氫甲醇阻斷30 min，體積分數(shù)0.1%Triton X-100孵育2 min，然后按TUNEL試劑盒說明書處理細胞，DAB染色后封片，高倍鏡下選取5個視野，每個視野計數(shù)每100個細胞中凋亡小體的數(shù)目，取均數(shù)，計算凋亡率。實驗重復3次。

1.5 細胞遷移實驗 制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度至5×104mL－1，每組設3個孔，Transwell小室上室加入細胞懸液，200 μL/孔，下室加入含體積分數(shù)20%血清的培養(yǎng)基，500 μL/孔，培養(yǎng)6 h后甲醇固定5 min，蘇木素染色30 min。擦去上室細胞后倒置小室，倒置顯微鏡下選取5個高倍視野計數(shù)遷移細胞后取均數(shù)。實驗重復3次。

1.6 Western blot 收集細胞，IP及WB蛋白提取液提取細胞總蛋白，各取40 μg總蛋白進行100 g/L SDS-PAGE電泳，20 V恒壓半干轉至PVDF膜，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST 4℃封閉過夜，分別用KLK14抗體(按 1∶500稀釋)、β-actin抗體(按1∶400稀釋)、Caspase-3(按1∶500稀釋)、Caspase-9(按1∶1000稀釋)、MMP2(按1∶600稀釋)和MMP9(按1∶600稀釋)室溫孵育1.5 h。二抗采用辣根過氧化物酶標記的相應IgG(按1∶5000稀釋)，室溫孵育1.5 h，ECL發(fā)光試劑盒處理后曝光。Image-Pro Plus 6.0系統(tǒng)采集、分析圖像，以目的蛋白/β-actin的比值表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較空白組、對照組和實驗組OVCAR-3細胞中KLK14 mRNA與蛋白及 Caspase-3、Caspase-9、MMP2和MMP9蛋白表達的差異以及細胞凋亡率和遷移細胞數(shù)的差異，組間兩兩比較采用 Bonferroni檢驗，檢驗水準 α =0.05。

2 結果

2.1 3組細胞中KLK14 mRNA和蛋白的表達見圖1、表1。

2.2 3組細胞凋亡率比較 空白組、對照組和實驗組OVCAR-3細胞的凋亡率分別為(4.7±2.1)%、(7.3 ±2.1)%和(30.3 ±2.9)%，實驗組 OVCAR-3細胞的凋亡率明顯高于其他2組細胞(F=54.313，P ＜0.001)，見圖2。

圖1 3組細胞中KLK14 mRNA和蛋白的表達

表1 3組OVCAR-3細胞中KLK14 mRNA及蛋白的表達

2.3 3組細胞遷移能力比較 空白組、對照組和實驗組OVCAR-3遷移細胞數(shù)分別為(67.7±2.5)、(66.0 ±5.3)和(29.7 ±3.8)個，實驗組 OVCAR-3細胞遷移能力低于其他2組(F=85.283，P=0.013)，見圖3。

2.4 3 組細胞中 Caspase-3、Caspase-9、MMP2 和MMP9蛋白的表達比較 見圖4、表2。

圖2 3組細胞的凋亡情況(DAB，×400)

圖3 3組細胞的遷移情況(蘇木素，×400)

圖4 3組細胞中Caspase-3、Caspase-9、MMP2和MMP9蛋白的表達

表2 3組OVCAR-3細胞中Caspase-3、Caspase-9、MMP2和 MMP9蛋白的表達

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，近年來其死亡率高居婦科惡性腫瘤之首[5]。作者所在的課題組的前期研究[6-7]顯示，卵巢上皮性癌組織中存在KLK14的高表達，KLK14的異常表達可能與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。KLK14基因在多種惡性腫瘤組織和腫瘤細胞系中存在異常表達，例如乳腺、卵巢、前列腺、睪丸、肺、結腸、唾液腺等部位的惡性腫瘤組織，并與相關腫瘤的發(fā)生發(fā)展及疾病的預后有密切關系[8-14]。

在惡性腫瘤的發(fā)病中抵抗程序性細胞死亡以及侵襲和轉移能力的激活是大多數(shù)惡性腫瘤細胞生理學特點的重要共性改變[15]。目前，KLK14基因與卵巢癌細胞凋亡和遷移的關系尚不清楚。

該研究中作者采用KLK14shRNA轉染OVCAR-3細胞后，OVCAR-3細胞中 KLK14 mRNA及蛋白的表達明顯降低，細胞凋亡率升高，遷移能力受抑。此外，該研究結果還顯示，轉染KLK14 shRNA的OVCAR-3細胞中凋亡相關基因caspase-3和caspase-9的表達明顯增加，與細胞侵襲和遷移性能相關的MMP2和MMP9蛋白的表達明顯降低。上述結果亦印證了下調(diào)KLK14表達可抑制卵巢癌OVCAR-3細胞的惡性行為。

綜上所述，KLK14基因受到抑制后可誘導細胞凋亡、抑制細胞的遷移能力;KLK14可作為卵巢癌治療干預的目標。在此基礎上進一步研究KLK14基因與卵巢癌的關系，有助于進一步闡明卵巢癌發(fā)病的分子機制，從而為卵巢癌的治療干預提供新的分子生物學靶點。

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