陳 娟，李 娟，譚 軍

1)河南省榮軍醫(yī)院心腦血管科 新鄉(xiāng) 453000 2)新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 新鄉(xiāng) 453000 3)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 新鄉(xiāng) 453003

肌苷是腺苷的代謝產(chǎn)物，有研究[1-2]表明肌苷作為促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突再生的小分子物質(zhì)，參與神經(jīng)細(xì)胞的自修復(fù)過程。腺苷在腦缺血再灌注損傷中的作用是腦缺血疾病相關(guān)基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)[3-5]。大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型是基礎(chǔ)研究中常用的局灶性腦缺血模型。該研究以MCAO模型大鼠為研究對(duì)象，通過對(duì)比分析正常大鼠、單純MCAO模型大鼠、腺苷預(yù)處理后的MCAO模型大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分、巢蛋白(Nestin)及Wnt1蛋白的表達(dá)情況，探討腺苷對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制，為臨床應(yīng)用腺苷治療腦缺血疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 清潔級(jí)成年健康雄性SD大鼠36只，體重200～250 g，購自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。腺苷購自美國Amresco公司，兔抗大鼠Nestin、Wnt1多克隆抗體、SP-0023免疫組化試劑盒購自北京博奧森公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 用隨機(jī)數(shù)字表法將36只大鼠分為假手術(shù)組、模型組和腺苷預(yù)處理組，每組12只。參考文獻(xiàn)[6]制作大鼠MCAO模型，術(shù)后2 h將線栓向外拔出1 cm行再灌注。假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎和插線，其余手術(shù)操作同模型組。腺苷預(yù)處理組大鼠在造模前3 d經(jīng)腹腔注射腺苷1.5 mg/kg(溶于2 mL生理鹽水中)，1次/d。假手術(shù)組和模型組大鼠在相同時(shí)間腹腔注射等體積生理鹽水。

1.3 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 缺血再灌注7 d后采用5分制法[6]對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。

1.4 各組大鼠腦組織中Nestin蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè) 神經(jīng)功能缺損評(píng)分完成后，用100 g/L的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，斷頭開顱取腦組織，制成20 μm厚冰凍切片，PBS浸洗，微波抗原修復(fù)(96℃，15 min)，于體積分?jǐn)?shù)為3%的去離子H2O2中37℃孵育10 min，PBS浸洗，山羊血清室溫孵育15 min，加兔抗大鼠Nestin多克隆抗體(按1∶200稀釋)，4℃過夜;陰性對(duì)照一抗用PBS替代;用SP試劑盒進(jìn)行Nestin免疫組化檢測(cè)，DAB顯色，脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下(×200)觀察，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒為Nestin陽性細(xì)胞，每張切片選擇5個(gè)視野，每視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞計(jì)算陽性細(xì)胞百分率。

1.5 各組大鼠腦組織中Wnt1蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè) 取腦組織，冰上分離右側(cè)海馬，加入裂解液，冰上裂解、勻漿，4℃低溫離心機(jī)15000 r/min離心30 min，取上清。以SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯膜上，用50 g/L脫脂牛奶封閉2 h，然后棄去封閉液，加入一抗，封閉袋中4℃過夜，棄去一抗，用TBS洗10 min×3次。棄去TBS，加入二抗，37℃孵育1 h;棄去二抗，用TBS洗10 min×3次。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯影，用凝膠成像分析儀采集圖像，用Image圖像處理軟件進(jìn)行吸光度分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，應(yīng)用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)比較各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦組織中Nestin陽性細(xì)胞百分率及海馬區(qū)腦組織中Wnt1蛋白表達(dá)的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦組織中Nestin陽性細(xì)胞百分率的比較 見圖1和表1。假手術(shù)組大鼠均無神經(jīng)功能缺損癥狀，模型組和腺苷預(yù)處理組大鼠均有不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀;腺苷預(yù)處理組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分低于模型組。腺苷預(yù)處理組和模型組大鼠腦組織中Nestin陽性細(xì)胞百分率高于假手術(shù)組，腺苷預(yù)處理組高于模型組。

2.2 各組大鼠腦組織中Wnt1蛋白表達(dá)的比較見表1。

圖1 各組大鼠腦組織中Nestin陽性細(xì)胞的表達(dá)(SP，×200)

表1 3組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦組織中Nestin陽性細(xì)胞百分率比較

3 討論

Nestin是一種僅在胚胎發(fā)育早期神經(jīng)上皮表達(dá)的中間絲蛋白，Nestin陽性表達(dá)的細(xì)胞可看作是神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSC)[7]。研究[8-9]顯示，腦缺血后3～7 d，缺血損傷的側(cè)腦室下區(qū)、紋狀體及皮質(zhì)區(qū)可觀察到Nestin蛋白表達(dá)增多，并于7 d時(shí)達(dá)到最大值;提示隨著細(xì)胞微環(huán)境的改變，NSC可以被激活。該研究結(jié)果顯示，大鼠腦缺血再灌注后Nestin陽性細(xì)胞增加，進(jìn)一步證實(shí)了腦缺血損傷后內(nèi)源性NSC的增殖。

腺苷是一種內(nèi)源性嘌呤核苷酸，可通過激活相應(yīng)的腺苷受體對(duì)受損腦組織發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10-12]。研究[13]表明腺苷可以明顯增加 NSC的增殖，可在一定程度上改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦缺血后的神經(jīng)功能損傷。該研究結(jié)果顯示，腺苷預(yù)處理組大鼠腦組織Nestin表達(dá)較模型組顯著增加，提示腺苷預(yù)處理可促進(jìn)內(nèi)源性NSC的增殖，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制目前尚不清楚。Wnt1蛋白是成體干細(xì)胞的外源性調(diào)控因子，是一種富含半胱氨酸殘基的分泌信號(hào)糖蛋白，參與調(diào)控動(dòng)物胚胎發(fā)育、細(xì)胞命運(yùn)及組織器官形態(tài)的形成[14-15]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠腦缺血再灌注時(shí)Wnt1的時(shí)間依賴性表達(dá)與NSC的增殖過程相吻合[16]，在應(yīng)用Wnt信號(hào)通路特異性阻斷劑后，腦缺血再灌注時(shí)NSC的增殖、分化受到明顯抑制[17]，這些均表明Wnt蛋白具有調(diào)控 NSC增殖、分化的作用。該研究采用Western blot方法觀察到假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)Wnt1蛋白表達(dá)極低，模型組與腺苷預(yù)處理組Wnt1蛋白的表達(dá)明顯增加，腺苷預(yù)處理組Wnt1蛋白的表達(dá)明顯高于模型組;提示腺苷可使腦缺血再灌注時(shí)腦組織中Wnt1蛋白表達(dá)上調(diào);推測(cè)Wnt1蛋白可能在內(nèi)源性NSC增殖過程中起著重要的正向調(diào)控作用。

綜上所述，腺苷可能通過上調(diào)Wnt1蛋白的表達(dá)、促進(jìn)內(nèi)源性NSC增殖而改善腦缺血損傷后的神經(jīng)功能，但其具體作用機(jī)制目前尚不清楚，仍需進(jìn)一步深入研究。

[1]Haskó G，Sitkovsky MV，Szabó C.Immunomodulatory and neuroprotective effects of inosine[J].Trends Pharmacol Sci，2004，25(3):152

[2]Litsky ML，Hohl CM，Lucas JH，et al.Inosine and guanosinepreserve neuronal and glial cell viability in mouse spinal cord cultures during chemical hypoxia[J].Brain Res，1999，821(2):426

[3]譚軍，孫兆印.腺苷預(yù)處理對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響[J].中國實(shí)用醫(yī)刊，2008，35(21):1

[4]尉娜，譚軍，路坦.腺苷預(yù)處理對(duì)大鼠缺血再灌注損傷的保護(hù)作用和機(jī)制[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2011，14(3):1

[5]Zhang B，Wang RZ，Lian ZG，et al.Neurogenesis by activation of inherent neural stem cells in the rat hippocampus after cerebral infarction[J].Chinese Med Sci J，2009，24(1):41

[6]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20(1):84

[7]Wang YZ，Plane JM，Jiang P，et al.Concise review:Quiescent and active states of endogenous adult neural stem cells:identification and characterization[J].Stem Cells，2011，29(6):907

[8]Yu J，Zeng J，Cheung RT，et al.Intracerebroventricular injection of epidermal growth factor reduces neurological deficit and infarct volume and enhances nestin expression following focal cerebral infarction in adult hypertensive rats[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2009，36(5/6):539

[9]Shen CC，Yang YC，Chiao MT，et al.Characterization of endogenous neural progenitor cells after experimental ischemic stroke[J].Curr Neurovasc Res，2010，7(1):6

[10]Ribeiro JA，Sebastiao AM，De Mendonca A.Participation of adenosine receptors in neuroprotection[J].Drug News Perspect，2003，16(2):80

[11]Asghari AA，Azarnia M，Mirnajafi-Zadeh J，et al.Adenosine A1 receptor agonist，N6-cyclohexyladenosine，protects myelin and induces remyelination in an experimental model of rat optic chiasm demyelination;electrophysiological and histopathological studies[J].J Neurol Sci，2013，325(1/2):22

[12]Migita H，Kominami K，Higashida M，et al.Activation of adenosine A1 receptor-induced neural stem cell proliferation via MEK/ERK and Akt signaling pathways[J].J Neurosci Res，2008，86(13):2820

[13]Okano H.Neural stem cells and strategies for the regeneration of the central nervous system[J].Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci，2010，86(4):438

[14]Wexler EM，Paucer A，Kornblum HI，et al.Endogenous Wnt signaling maintains neural progenitor cell potency[J].Stem Cells，2009，27(5):1130

[15]Guo YJ，Zhang ZJ，Wang SH，et al.Notch1 signaling，hippocampal neurogenesis and behavioral responses to chronic unpredicted mild stress in adult ischemic rats[J].ProgNeuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2009，33(4):688

[16]邢雪松，呂威力.Wnt-1在大鼠腦缺血再灌注海馬組織內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞早期增殖分化中的作用[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11(3):412

[17]Chen BY，Wang X，Wang ZY，et al.Brain-derived neurotrophic factor stimulates proliferation and differentiation of neural stem cells，possibly by triggering the Wnt/β-catenin signaling pathway[J].J Neurosci Res，2013，91(1):30