李 超，錢(qián)新華，千新來(lái)，付琳琳，吳 余

1)南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院新生兒科 廣州 510515 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 新鄉(xiāng) 453003

白血病是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)是增殖失控、凋亡受阻及分化障礙[1]。黃芪為豆科植物屬蒙古黃芪、膜莢黃芪的干燥根，黃芪多糖(astragalus polydsaccharide，APS)是黃芪的主要活性成分之一[2-3]，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、強(qiáng)心降壓、降血糖、抗應(yīng)激、抗病毒、抗輻射、抗氧化等多種藥理功效[4-8]。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)APS在體內(nèi)外對(duì)多種惡性腫瘤有明顯的抑制作用。許杜娟等[8]發(fā)現(xiàn)，黃芪總提取物能明顯抑制小鼠實(shí)體型腫瘤的生長(zhǎng)，并可引起肝癌細(xì)胞系發(fā)生凋亡;而劉兵榮等[9]研究發(fā)現(xiàn)，APS可通過(guò)抑制核因子NF-κB表達(dá)而抑制大鼠腦出血后的細(xì)胞凋亡，提示APS與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制值得深入研究。作者采用流式細(xì)胞術(shù)、Caspase-3活性測(cè)定等方法，通過(guò)RT-PCR和 Western blot方法檢測(cè) Bcl-2、Bcl-XL、Bax、IAP-1和Smac mRNA和蛋白的表達(dá)，探討APS對(duì)人紅白血病K562細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制，以期為APS用于白血病的治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系來(lái)源及培養(yǎng) K562細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和青/鏈霉素(青霉素 100 U/mL，鏈霉素100 mg/L)的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 FBS為杭州四季青公司產(chǎn)品;RPMI 1640培養(yǎng)基、Trizol試劑、100 bp DNA Marker為美國(guó)Invitrogen產(chǎn)品;RT-PCR試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs為日本TaKaRa公司產(chǎn)品;所有抗體及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒均為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品;Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究公司;CaspACETM Assay System、Colorimetric試劑盒為Promega公司產(chǎn)品。

1.3 PCR引物序列和目的片段長(zhǎng)度 PCR引物由英濰捷基上海公司合成。引物序列和目的片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列和目的片段長(zhǎng)度

1.4 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 收集K562細(xì)胞(對(duì)照組)和200 mg/L APS誘導(dǎo)48 h的K562細(xì)胞(APS組，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇該劑量和時(shí)間)并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。用195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入 5 μL Annexin V-FITC，避光孵育 10 min，1000 r/min 離心 5 min，棄上清，用 190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入10 μL碘化丙啶染色液，避光冰上孵育后，上流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣本。

1.5 細(xì)胞中Caspase-3活性測(cè)定 提取對(duì)照組和APS組K562細(xì)胞總蛋白并定量。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Caspase-3活性測(cè)定。96孔板中依次加入如下成分制備反應(yīng)混合物:Caspase分析緩沖液32 μL、二甲基亞砜 2 μL、二硫蘇糖醇(100 mmol/L)10 μL、蛋白 62.5 μg，補(bǔ)水至 98 μL。每組均設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不加蛋白的空白對(duì)照孔。加AC-DEVA-PNA底物2 μl/孔，避光，37 ℃溫育 4 h，測(cè)定 405 nm 處的光密度值(OD)，計(jì)算各組均值，并以各組均值與空白對(duì)照均值的差值表示Caspase-3活性。

1.6 細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因mRNA的RT-PCR檢測(cè) 提取對(duì)照組和APS組K562細(xì)胞總RNA并定量，體外合成cDNA第一條鏈，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。通過(guò)Bandleader 3.0軟件分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物目的條帶與內(nèi)參照條帶的灰度比值。

1.7 細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因蛋白的Western blot檢測(cè) 提取對(duì)照組和APS組K562細(xì)胞總蛋白并定量，通過(guò)Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白。以β-actin為內(nèi)參照。上樣量為100 μg，鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人Bcl-XL多克隆抗體、鼠抗人Bax單克隆抗體、兔抗人Smac多克隆抗體、兔抗人IAP-1多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗和辣根酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗的稀釋度分別為 150、100、150、150、100、300、2500和2500倍。通過(guò)Bandscan 5.0軟件分析目的條帶灰度值與內(nèi)參照條帶灰度值的比值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行分析。應(yīng)用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較2組K562細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞中 Bcl-2、Bcl-XL、Bax、IAP-1 和 Smac mRNA和蛋白表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 APS對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響 APS組K562細(xì)胞凋亡數(shù)(3322.000±413.849高于對(duì)照組(101.333 ±18.339)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.466，P ＜0.001)。

2.2 APS對(duì)K562細(xì)胞中Caspase-3活性的影響與對(duì)照組(0.085±0.018)相比，APS組 K562細(xì)胞中 Caspase-3 活性(0.354 ±0.036)升高(t=11.562，P ＜0.001)。

2.3 APS 對(duì) K562 細(xì)胞中 Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Smac和IAP-1表達(dá)的影響 見(jiàn)圖1、2和表2、3。

圖1 APS對(duì)K562細(xì)胞中Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Smac和IAP-1 mRNA表達(dá)水平的影響

圖2 APS對(duì)K562細(xì)胞中Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Smac和IAP-1蛋白水平表達(dá)的影響

表2 2組細(xì)胞中Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Smac和IAP-1 mRNA的表達(dá)

表3 2組細(xì)胞中 Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Smac和 IAP-1蛋白的表達(dá)

3 討論

正常情況下細(xì)胞的增殖與凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡中，以維持機(jī)體的自身穩(wěn)定性。細(xì)胞增殖失控和(或)凋亡受阻均可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。細(xì)胞凋亡受一系列基因調(diào)控。Caspase家族是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子，其家族成員均具有半胱氨酸蛋白酶活性，其中Caspase-8和Caspase-9位于凋亡途徑的上游，分別介導(dǎo)死亡受體途徑和線粒體途徑細(xì)胞凋亡，Caspase-3為凋亡的效應(yīng)因子，被稱(chēng)為凋亡“執(zhí)行者”，它們的級(jí)聯(lián)激活引發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡[10-11]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，許多中藥或其有效成分可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。該研究結(jié)果顯示，APS組K562細(xì)胞凋亡數(shù)高于對(duì)照組;與對(duì)照組相比，APS組K562細(xì)胞中Caspase-3活性顯著增加，說(shuō)明APS能誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Bcl-2家族是對(duì)Caspase的激活進(jìn)行調(diào)控的一類(lèi)重要的蛋白因子，Bcl-2家族蛋白主要通過(guò)線粒體途徑參與凋亡調(diào)控。根據(jù)在凋亡中所起作用，可將Bcl-2家族蛋白分為兩大類(lèi)型:抑制凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-XL等)和促凋亡蛋白(如 Bax等)。Bcl-2、Bcl-XL可抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，而B(niǎo)ax通過(guò)其編碼產(chǎn)物與Bcl-2蛋白形成異源二聚體使其失活，從而激活Caspase或獨(dú)立地破壞核內(nèi)染色質(zhì)，引起細(xì)胞凋亡[13-14]。谷俊朝等[15]研究發(fā)現(xiàn)，APS 可抑制乳癌中Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)乳癌細(xì)胞的凋亡。該研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，APS組K562細(xì)胞中Bcl-2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著降低，而B(niǎo)ax在mRNA和蛋白水平表達(dá)均顯著增加，Bcl-XL在mRNA和蛋白水平的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明APS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與其下調(diào)Bcl-2的表達(dá)和上調(diào)Bax的表達(dá)密切相關(guān)，而B(niǎo)cl-XL可能在APS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡中不起重要作用。

研究[16]發(fā)現(xiàn)，Smac可通過(guò)與IAPs結(jié)合或通過(guò)增強(qiáng)IAPs的自身泛素化降解以釋放Caspases而發(fā)揮其促凋亡活性。反之，Livin、XIAP等也可通過(guò)減少Smac的釋放或誘導(dǎo)Smac的泛素化降解而發(fā)揮抑制凋亡的作用[17-18]。該研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，APS組K562細(xì)胞中IAP-1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著降低，而Smac在mRNA和蛋白水平表達(dá)均顯著增加。IAP-1表達(dá)下調(diào)和Smac表達(dá)上調(diào)在APS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡中也發(fā)揮重要作用。

綜上所述，APS可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，APS的上述作用與抗凋亡基因Bcl-2和IAP-1表達(dá)下調(diào)及促凋亡基因Smac和Bax表達(dá)上調(diào)有密切關(guān)系。但APS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制可能非常復(fù)雜，值得進(jìn)一步深入研究。

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