胡小寧，黃學(xué)勇，杜燕華，尤愛國，許汴利#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001 2)河南省疾病預(yù)防控制中心傳染病防治所 鄭州 450016

發(fā)熱伴血小板減少綜合征是近年來發(fā)生在我國河南、湖北、山東等地區(qū)的一種新發(fā)傳染病，2010年河南信陽報道“蜱咬人致死”事件后，該病備受各界關(guān)注。研究[1-2]證實發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV)是引起該綜合征的病原體。SFTSV屬于布尼亞病毒科白蛉熱病毒屬，與其他布尼亞病毒科病毒相類似，其基因組由大(L)、中(M)、小(S)3個單股負(fù)鏈RNA組成;其中S片段屬于雙義RNA，分別編碼核蛋白(nucleocapsid protein，NP)和非結(jié)構(gòu)蛋白[3-4]。在布尼亞病毒感染的臨床病例中，病毒NP是主要的免疫原，患者體內(nèi)相應(yīng)的抗體水平較高[5-6]。目前以部分布尼亞病毒科病毒NP作為目標(biāo)抗原的檢測試劑已廣泛應(yīng)用于實驗室檢測，如裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus，RVFV)、克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV) 等[5，7]。該研究擬構(gòu)建SFTSV NP的原核表達載體并表達、純化，獲取具有抗原性的重組NP;以純化的NP作為診斷抗原，建立檢測血清樣本中NP抗體的ELISA檢測方法，為后續(xù)血清學(xué)檢測試劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、毒株和標(biāo)本 菌株E.coli JM109和克隆載體pMD18-T購自大連寶生物工程有限公司，原核表達載體pMAL-c2x、SFTSV毒株SH105均由鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室保存。體檢健康人血清(48份)和信陽SFTSV流行區(qū)臨床診斷為SFTSV感染者急性期血清(96份)標(biāo)本由該教研室保存。

1.2 主要試劑和儀器 RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司，SFTSV RNA檢測試劑盒(RT-PCR熒光探針法)購自北京華大吉比愛生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、HindⅢ以及其他酶類均購自大連寶生物工程有限公司，膠回收試劑盒購自杭州艾斯進公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，IPTG、X-Gal、NC 膜、鼠抗人 IgG、HRP 標(biāo)記羊抗人IgM以及TMB底物、顯色試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司，PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、蛋白半干轉(zhuǎn)膜儀、酶標(biāo)儀均購自BIO-RAD公司，Amylose樹脂預(yù)裝柱、蛋白純化儀均購自GE公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計 參照 BX-2010/Henan/CHN strain河南分離株HQ642768.1基因組序列，利用Primer 5.0設(shè)計針對NP基因的PCR上游引物序列(NK1-1:5'-GCTCTAGAATGTCAGAGTGGTCCAGAAT-3')和下游引物序列(NK1-2:5'-CGCAAGCTTTTACAGGT TCCTGTAAGCAG-3')，分別在上、下游引物序列引入XbaⅠ和HindⅢ酶切位點，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 NP基因PCR擴增 取SFTSV細胞培養(yǎng)物140 μL提取病毒RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后通過PCR擴增NP基因。50 μL的反應(yīng)體系中加入Extaq 25 μL、上下游引物各 1 μL、cDNA 1 μL，最后加不含RNase ddH2O至終體積。擴增條件:95℃預(yù)變性3 min;94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán);72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物以15 g/L瓊脂糖電泳鑒定。

1.5 NP原核表達載體的構(gòu)建和鑒定 PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂抹于LB固體培養(yǎng)基(氨芐青霉素 100 mg/L，IPTG 24 mg/L，X-Gal 40 mg/L)，于37℃條件下培養(yǎng)過夜。挑選陽性單克隆菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切鑒定并送至南京金斯瑞科技有限公司進行測序。分別將測序正確的重組質(zhì)粒和表達載體pMAL-c2x經(jīng)XbaⅠ、HindⅢ雙酶切后回收目的片段，回收產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細胞中。菌液提取質(zhì)粒后酶切鑒定。

1.6 目的蛋白的誘導(dǎo)表達 取酶切鑒定正確的菌液按1∶100體積比接種于LB液體培養(yǎng)基(氨芐青霉素100 mg/L)，37℃振蕩培養(yǎng)至OD≈0.5時，加入不同濃度的IPTG(0.8和1.0 mmol/L)分別誘導(dǎo)培養(yǎng) 3.0、3.5、4.0、4.5 h 以確定蛋白適宜表達條件。在優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件下大量誘導(dǎo)表達菌液200 mL，離心收集菌體于－40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 表達產(chǎn)物的純化和Western blot分析 將誘導(dǎo)表達后的產(chǎn)物于室溫融化，加入10 mL PBS重懸浮，離心棄上清后加10 mL過柱緩沖液(20 mmol/L Tris-HCL，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DDT，pH=7.4)冰浴超聲 10 min。4 ℃8000 g離心5 min后分別取上清和沉淀行SDSPAGE，電泳后考馬斯亮藍R250染色并觀察。超聲后的上清液經(jīng)0.22 μm濾紙過濾并過Amylose樹脂預(yù)裝柱(按儀器操作步驟進行)，最后用洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCL，200 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L maltose，1 mmol/L DDT，pH=7.4)洗脫收集蛋白，SDS-PAGE觀察純化結(jié)果。電泳后將純化蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，50 g/L脫脂牛奶封閉1 h;封閉后加入SFTSV急性期患者血清(按1∶50稀釋)孵育1 h，同時以健康人血清作為對照;加堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的鼠抗人IgG(按1∶1000稀釋)孵育1 h顯色觀察。

1.8 ELISA方法的建立與檢測效果的評價 用包被緩沖液將純化的 NP稀釋至10 mg/L，每孔150 μL包被酶標(biāo)板，4℃過夜，PBST洗滌3次;加入150 μL 封閉液37 ℃封閉2 h，加入100 μL 待測血清(按1∶10稀釋)37℃孵育30 min;洗板后加入100 μL HRP標(biāo)記羊抗人 IgM(按1∶1000稀釋)，37℃反應(yīng)30 min;每孔分別加入底物TMB溶液和顯色液50 μL，37℃反應(yīng)10 min;最后加入終止液50 μL。酶標(biāo)儀于450 nm處測定OD值。對48例健康人血清樣本進行檢測，以P/N≥2.1為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)值，以建立的ELISA法和實時熒光定量PCR法(逆轉(zhuǎn)錄50℃30 min;95℃預(yù)變性15 min;95℃變性15 s，60℃退火40 s并收集FAM熒光信號，40個循環(huán)。檢測結(jié)果Ct值≤35為陽性)同時對96份SFTSV感染者樣本進行檢測，確定ELISA方法的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴增 測序結(jié)果顯示，SFTSV NP的基因長度為738 bp。該基因與GenBank上Orthobunyavirus 69號分離株(登錄號JF682778.1)的NP基因序列完全相同。

2.2 重組表達載體 pMAL-c2x-NP的鑒定pMAL-c2x-NP小提質(zhì)粒后經(jīng)XbaⅠ、HindⅢ雙酶切獲得結(jié)果相一致的目的條帶(圖1)，表明重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 重組蛋白的表達、純化和Western blot分析不同濃度的IPTG均可誘導(dǎo)目的蛋白的表達，隨著誘導(dǎo)時間的增加，融合蛋白的表達量有所增加，表達量差異并不明顯(圖2)。該實驗選取IPTG終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)表達4 h。融合蛋白的可溶性結(jié)果分析顯示，目的蛋白雖然主要以包涵體形式表達，但上清中可溶性重組蛋白含量可滿足通過Amylose樹脂預(yù)裝柱純化的需要(圖3)。Western blot結(jié)果顯示SFTSV感染者血清與融合蛋白在約70000處有一條特異雜交帶，融合蛋白對識別SFTSV感染者血清具體良好的特異性(圖4)。

圖1 pMAL-c2x-NP的酶切鑒定結(jié)果

圖2 不同誘導(dǎo)條件下pMAL-c2x-NP的表達

圖3 重組蛋白的可溶性分析結(jié)果

圖4 純化融合蛋白的Western blot分析

2.4 ELISA方法的檢測效果 48份健康人血清抗NP抗體OD值的平均值=0.099。以建立的方法對96例臨床診斷SFTSV急性期患者血清標(biāo)本進行檢測，陽性率為40.6%(39/96);實時熒光定量 PCR法檢測的陽性率為55.2%(53/96)。兩者符合率為77.1%，一致性檢驗較好，見表1。

表1 2種檢測方法檢測結(jié)果的一致性檢驗

3 討論

近年來，蟲媒病毒嚴(yán)重威脅著人類的健康[8]。作為一種蜱傳新發(fā)傳染病，目前已建立多種針對SFTSV的實驗室檢測方法，包括病毒分離、RT-PCR、IFA以及實時熒光定量PCR等[9-10]，而上述方法對實驗設(shè)備和實驗人員都有較高的要求。血清學(xué)的檢測既能彌補基層實驗條件的不足，又可用于流行病學(xué)調(diào)查。NP在病毒顆粒內(nèi)通過與病毒基因組RNA和RNA聚合酶結(jié)合形成NP體(ribonucleoprotein，RNP)，同時又具有同型寡聚化和RNA結(jié)合的特性，這些特性使得NP在病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制過程中起著重要的作用。針對SFTSV構(gòu)建的合成噬菌體抗體庫的研究[11]表明，94種人源多克隆抗體均可識別SFTSV的NP，而不與外膜蛋白發(fā)生反應(yīng)。研究[12]也顯示利用SFTSV感染者血清檢測NP的病毒顆粒和重組蛋白，結(jié)果均呈現(xiàn)強陽性，而其他的靶標(biāo)蛋白如外膜蛋白等結(jié)果具有不穩(wěn)定性，可見NP特異性抗體在SFTSV感染者血清中的表達水平較高。針對NP的單克隆抗體研究[13-14]也顯示在檢測臨床病例中NP較高的親和力與高度的特異性，這些都證明NP在SFTSV早期診斷過程中起著至關(guān)重要的作用。而河南、山東、湖北等地發(fā)現(xiàn)的SFTSV基因組序列高度同源，這為后續(xù)實驗的廣泛應(yīng)用提供了保障。

有研究[15]利用pEASY-E1表達系統(tǒng)獲取蜱傳森林腦炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。該實驗采用的原核表達載體pMAL-c2x含有強啟動子tac，可以高效表達外源蛋白。作者在實驗過程中發(fā)現(xiàn)上清中融合蛋白的表達量完全可滿足純化的需要，這可能是該載體具有E.coli malE翻譯起始信號，可引導(dǎo)融合蛋白穿過胞質(zhì)膜進入周質(zhì)有關(guān)。MBP的相對分子質(zhì)量為42000，因此NP的相對分子質(zhì)量大約在28000，與文獻[12]報道一致。利用該蛋白構(gòu)建的ELISA檢測方法和實時熒光定量法對臨床血清樣本檢測的結(jié)果符合率為77.1%。研究[16]顯示當(dāng)血清樣本采樣時間小于3 d時，僅能通過實時熒光定量PCR檢測;同時由于ELISA方法在實驗條件方面還需進一步優(yōu)化，這可能是兩者結(jié)果差異的原因。

該研究通過構(gòu)建SFTSV NP基因的原核表達載體，優(yōu)化融合蛋白的表達條件，經(jīng)過親和層析后獲得純化的重組融合蛋白。經(jīng)Western blot證實該融合蛋白具有抗原性，用建立的ELISA方法對臨床樣本做了初步檢測，為后續(xù)的SFTSV血清學(xué)檢測試劑的研發(fā)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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