徐良志，張 晨

1)核工業(yè)四一七醫(yī)院骨科 臨潼 710600 2)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院骨一科 西安 710004

近年研究[1]發(fā)現(xiàn)，骨組織存在局部的腎素-血管緊張素系統(tǒng)，而且對(duì)骨骼的生長(zhǎng)、發(fā)育及代謝發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要效應(yīng)肽，具有重要的生理功能。骨組織局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)主要表現(xiàn)在AngⅡ促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成和活化，其中破骨細(xì)胞分化因子(RANKL)便是其中之一[2-3]。白細(xì)胞介素-6(IL-6)同樣可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成和活化，在骨代謝中發(fā)揮重要作用[4]。但是AngⅡ是否能促進(jìn)成骨細(xì)胞IL-6的表達(dá)以及作用機(jī)制還不明確。以前的研究[5]表明，細(xì)胞內(nèi)活性氧和NF-κB信號(hào)通路在調(diào)節(jié)IL-6的表達(dá)中發(fā)揮了非常重要的作用。而在其他研究[6-7]中發(fā)現(xiàn)AngⅡ可以增加細(xì)胞內(nèi)活性氧以及激活NF-κB信號(hào)通路。為此，作者利用小鼠成骨樣細(xì)胞株MC3T3-E1來(lái)研究AngⅡ是否能促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)IL-6以及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 小鼠成骨樣細(xì)胞株MC3T3-E1購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗、Trizol試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，AngⅡ、奧美沙坦(olmsartan，Olm)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyleysteine，NAC)，2'，7'-二氯熒光黃二乙酸酯(DCFH-DA)、吡咯烷二硫代甲酸銨鹽(PDTC)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗小鼠NF-κB p65抗體和磷酸化p65(p-p65)抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自加拿大Fermentas公司，IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司，PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，RIPA裂解液購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，垂直板電泳儀購(gòu)自北京六一廠，轉(zhuǎn)移電泳槽購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司，熒光顯微鏡數(shù)碼照相系統(tǒng)購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 先將MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)蘇，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。每2 d更換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106mL－1，然后分為5組:對(duì)照組(用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng))、AngⅡ處理組[給予AngⅡ處理24 h(預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AngⅡ?qū)Τ晒羌?xì)胞IL-6 mRNA的促進(jìn)作用隨著其濃度的增加而增加，故選用10－6mol/L AngⅡ?qū)?xì)胞進(jìn)行干預(yù))]、AngⅡⅠ型受體阻滯劑Olm+AngⅡ處理組(10－5mol/L Olm預(yù)孵育1 h，再給予10－6mol/L AngⅡ處理24 h)、氧自由基清除劑 NAC+AngⅡ處理組(10－3mol/L NAC預(yù)孵育1 h，再給予10－6mol/L AngⅡ處理24 h)、NF-κB信號(hào)通路阻滯劑PDTC+AngⅡ處理組(10－4mol/L PDTC 預(yù)孵育 1 h，再給予 10－6mol/L AngⅡ處理24 h)。每組均設(shè)5個(gè)平行對(duì)照。

1.3 各組細(xì)胞中IL-6 mRNA的RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞給予不同干預(yù)(實(shí)驗(yàn)分組同1.2)后，用Trizol試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用PCR Mix試劑和PCR擴(kuò)增儀按照說(shuō)明書(shū)步驟及要求進(jìn)行擴(kuò)增后，取擴(kuò)增產(chǎn)物行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的基因條帶與GAPDH條帶灰度值的比值表示mRNA的相對(duì)表達(dá)量。IL-6上游引物序列5'-ACAAAGCCA GAGTCCTTCAGAG-3'，下游引物序列 5'-CCTTAGC CACTCCTTCTGTGACT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為378 bp;GAPDH上游引物序列5'-ACCACAGTCCATGCCAT CAC-3'，下游引物序列5'-TCCACCACCCTGTTGCTG TA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為486 bp。

1.4 各組細(xì)胞上清液中IL-6含量的ELISA測(cè)定細(xì)胞給予不同干預(yù)(實(shí)驗(yàn)分組同1.2)后，取上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在450 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定樣本的吸光度值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞上清液中IL-6的含量(ng/L)。

1.5 各組細(xì)胞內(nèi)活性氧的測(cè)定 細(xì)胞給予不同干預(yù)(實(shí)驗(yàn)分組同1.2)后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入稀釋好的DCFH-DA(用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋至終濃度為10－5mol/L)，加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，然后在熒光顯微鏡下采集圖像信息，每組采集2個(gè)視野，最后利用Image Pro Plus 4.5圖像分析軟件進(jìn)行熒光值分析。

1.6 各組細(xì)胞中 p65和 p-p65表達(dá)的 Western blot檢測(cè) 用細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞內(nèi)總蛋白，然后加入上樣緩沖液，煮沸，10 min變性。上樣量為15 μL/孔，然后進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h，然后加入兔抗小鼠p65和p-p65單克隆抗體4℃過(guò)夜。然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗室溫孵育2 h。最后在暗室中加ECL顯影，選β-actin作為內(nèi)參對(duì)目的蛋白進(jìn)行對(duì)比分析。采用Image Pro Plus 4.5圖像分析軟件進(jìn)行圖像的灰度定量分析。

1.7 各組細(xì)胞中p65核內(nèi)移的免疫熒光檢測(cè) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證NF-κB信號(hào)通路的被激活情況，利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，觀察p65蛋白的核內(nèi)移情況。調(diào)整細(xì)胞密度為5×106mL－1，然后按實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕o予各組細(xì)胞不同干預(yù)(實(shí)驗(yàn)分組同1.2)。40 g/L中性多聚甲醛固定，用2.5 g/L的 Triton X-100透膜，BSA封閉，然后加入兔抗小鼠p65一抗4℃過(guò)夜，熒光二抗在37℃下孵育2 h，DAPI染核3 min，最后在熒光顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組細(xì)胞中IL-6 mRNA和蛋白、活性氧、p65和p-p65表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá) 見(jiàn)表1。

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)活性氧的測(cè)定結(jié)果 見(jiàn)圖1、表2。

表1 各組細(xì)胞中IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)

圖1 各組細(xì)胞內(nèi)活性氧的測(cè)定結(jié)果(×400)

表2 各組細(xì)胞內(nèi)活性氧、p65和p-p65表達(dá)的比較

2.3 各組細(xì)胞中p65和p-p65表達(dá)的結(jié)果 見(jiàn)圖2、表2。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，AngⅡ可以明顯增加p65蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)，這種現(xiàn)象可以被Olm、NAC以及PDTC所抑制(圖3)。

圖2 各組細(xì)胞中p65和p-p65的表達(dá)

圖3 各組細(xì)胞中p65的細(xì)胞內(nèi)定位(×400)

3 討論

細(xì)胞因子與骨吸收密切相關(guān)，并且參與一些疾病的發(fā)病過(guò)程，如骨質(zhì)疏松、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[8]。許多細(xì)胞因子是由成骨細(xì)胞分泌的，可以調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化、成熟以及成熟破骨細(xì)胞的激活[9]。而IL-6就是由成骨細(xì)胞分泌的、可以調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化、成熟以及成熟破骨細(xì)胞激活的細(xì)胞因子，它在骨代謝中發(fā)揮重要作用[4，10]。以前的研究[11]表明許多骨吸收因子如TNF-α、IL-1以及甲狀旁腺激素都可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌IL-6。

AngⅡ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要效應(yīng)肽[12-13]，它可以調(diào)節(jié)許多組織的生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡以及炎癥反應(yīng)[14-16]。研究[5]發(fā)現(xiàn) AngⅡ可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞以及單核細(xì)胞分泌IL-6和MCP-1，并且AngⅡⅠ型受體阻滯劑可以明顯降低慢性心力衰竭患者血清IL-6水平[17]，表明IL-6很可能是AngⅡ發(fā)揮生理效應(yīng)的中間介質(zhì)。

該研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ可以明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞IL-6的表達(dá)，但這種作用可以被其Ⅰ型受體阻滯劑Olm所阻斷，同樣，氧自由基清除劑NAC以及NF-κB信號(hào)通路阻滯劑PDTC可以阻斷AngⅡ?qū)Τ晒羌?xì)胞IL-6表達(dá)的促進(jìn)作用;AngⅡ可以明顯增加成骨細(xì)胞內(nèi)活性氧以及p65的磷酸化水平，并且還可以增加p65蛋白從胞漿到胞核的移動(dòng)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明了AngⅡⅠ型受體/活性氧/NF-κB信號(hào)通路在AngⅡ促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)IL-6的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

AngⅡ主要通過(guò)Ⅰ型和Ⅱ型受體發(fā)揮作用[18]，而作者的研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ促進(jìn)成骨細(xì)胞IL-6的表達(dá)主要通過(guò)Ⅰ型受體起作用。研究[6-7]表明，AngⅡ可以促進(jìn)心肌細(xì)胞、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)一些炎癥因子的表達(dá)。該研究同樣發(fā)現(xiàn)活性氧在AngⅡ促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)IL-6的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。而且，AngⅡ促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的作用可以被AngⅡⅠ型受體阻斷劑以及以自由基清除劑所阻斷，而NF-κB信號(hào)通路抑制劑對(duì)此卻沒(méi)有作用。NF-κB信號(hào)通路抑制劑可阻斷AngⅡ?qū)Τ晒羌?xì)胞IL-6表達(dá)的促進(jìn)作用。而AngⅡ同樣可以增加p65的磷酸化水平，這種作用也可以被AngⅡⅠ型受體阻斷劑、自由基清除劑和NF-κB信號(hào)通路抑制劑所阻斷。

綜上所述，AngⅡ首先通過(guò)AngⅡⅠ型受體促進(jìn)成骨細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，進(jìn)而作用于NF-κB信號(hào)通路，最后促進(jìn)成骨細(xì)胞高表達(dá)IL-6。

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