李 洋，朱穎軍，石巖蓉，林琬君

（天津醫(yī)科大學(xué)研究生院2011級(jí)，天津 300070；2.天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，天津 300100）

子宮內(nèi)膜癌（Endometrial Carcinoma，EMC）是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率成上升趨勢(shì)，且日趨年輕化，子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌的發(fā)病比率已從 60 年代的 1∶10 變?yōu)楝F(xiàn)今的 1∶1［1］。 據(jù)文獻(xiàn)［2］報(bào)道，丹麥每年有近600個(gè)新發(fā)病例，從而成為歐洲子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率最高的國(guó)家之一。有文獻(xiàn)［3］報(bào)道，子宮內(nèi)膜癌5年以上生存率為70%，5年生存率為81%，被認(rèn)為是可治愈癌癥。表皮生長(zhǎng)因子（EGF）相關(guān)蛋白包括 EGF、轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子 a（TGF－a）、補(bǔ)體受體（CR）、雙調(diào)蛋白（AR）和 EGF 受體（EGFR）。EGF家族普遍存在于人類(lèi)的各個(gè)組織器官中，并且在胚胎形成、生長(zhǎng)、增殖和分化等各個(gè)時(shí)期發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，同時(shí)它也參與了腫瘤的增殖、遷移、浸潤(rùn)、分化和血管的形成［4］。近年來(lái)，EGF相關(guān)蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況也逐漸受到了人們的關(guān)注。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

收集天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院2012年1月至2013年 1月的子宮內(nèi)膜病理切片（石蠟）標(biāo)本98例，年齡31～88歲，平均59.4歲。其中正常子宮內(nèi)膜14例，增生性子宮內(nèi)膜18例，子宮內(nèi)膜癌66例（均為子宮內(nèi)膜樣腺癌）。66例子宮內(nèi)膜癌中，Ⅰ級(jí):高分化（WD）23 例；Ⅱ級(jí):中分化（MD）19 例；Ⅲ級(jí):低分化（LD）24例。患者術(shù)前均未接受過(guò)類(lèi)固醇激素及放、化療的治療。

1.2 主要試劑

EGF、TGF－a（1∶1000）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；鼠源、兔源二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PCR引物購(gòu)自北京賽百勝生物公司（表1）；反轉(zhuǎn)錄試劑SYBR Premix Ex Taq和引物購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司（Valencia,CA）；倒置顯微鏡、分光光度計(jì)、mRNA檢測(cè)儀（美國(guó)Bio－Rad公司）realtime PCR 檢測(cè)儀（美國(guó) Bio－Rad公司）。

表1 EGF、TGF-a引物序列

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)

取石蠟切片常規(guī)進(jìn)行甲醇脫蠟，乙醇脫水；3%H2O237℃ 孵育10 min，抗原修復(fù)，血清稀釋液封閉，一抗（EGF、TGF－a 1∶100）4 ℃ 過(guò)夜，PBS 沖洗 3次，加二抗室溫 2 h，DAB染色，以細(xì)胞膜或胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒視為著色細(xì)胞（著色細(xì)胞＞50%判定為陽(yáng)性結(jié)果）。記錄陽(yáng)性結(jié)果的病例數(shù)。

1.3.2 Real－time PCR

從組織細(xì)胞中提取RNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和吸光值，將提取的1 μg RNA加到20 μL體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，之后用realtime PCR檢測(cè)儀進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，程序設(shè)定為初步變性95℃ 10 min，樣本經(jīng)過(guò)45次擴(kuò)充循環(huán)，模板變性95℃30 s，退火60℃30 s，延伸階段72℃30 s。結(jié)果統(tǒng)計(jì):用每個(gè)目的基因的Ct值減去對(duì)應(yīng)的βactin Ct值，得到△Ct，每個(gè)目的基因的相對(duì)表達(dá)量表示為2－△Ct，然后對(duì)各個(gè)樣本的表達(dá)量進(jìn)行比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2003，使用student-t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)方法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)水準(zhǔn)雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EGF、TGF-a蛋白在正常子宮內(nèi)膜、增生性子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果示:EGF在正常子宮內(nèi)膜組、增生性子宮內(nèi)膜組及子宮內(nèi)膜癌組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為 71.4%、72.2%和 57.6%，子宮內(nèi)膜癌組的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于正常子宮內(nèi)膜組及增生性子宮內(nèi)膜組（均 P＜0.05）；TGF－a 在正常子宮內(nèi)膜組、增生性子宮內(nèi)膜組及子宮內(nèi)膜癌組中的表達(dá)率分別為 42.9%、44.4%和 66.7%，子宮內(nèi)膜癌組的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常子宮內(nèi)膜組和增生性子宮內(nèi)膜組（均 P＜0.05）。 見(jiàn)表 2。 用 Real－time PCR 方法檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜組和子宮內(nèi)膜癌組組織中EGF及TGF－a的表達(dá)，結(jié)果與免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果相一致，EGF在子宮內(nèi)膜癌中相對(duì)低表達(dá)，TGF－a在子宮內(nèi)膜癌中呈高表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)圖 1。

表2 3組子宮內(nèi)膜組織中EGF、TGF-a的表達(dá)

圖1 子宮內(nèi)膜癌中EGF及TGF-a的表達(dá)

2.2 EGF、雌二醇（E2）及TGF-a在不同分化程度子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)

采用Real-time PCR方法分別檢測(cè)高、中、低分化的子宮內(nèi)膜癌中EGF、TGF-a及E2的表達(dá)，結(jié)果顯示:EGF在不同分化程度的子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)無(wú)明顯差異；E2在高分化的子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)程度較高，而TGF-a在低分化的子宮內(nèi)膜癌中呈現(xiàn)高表達(dá)（圖 2）。

圖2 不同分化程度子宮內(nèi)膜癌中EGF及TGF-a的表達(dá)

3 討論

EGF是Cohen（1962）首次在小鼠的頜下腺中發(fā)現(xiàn)的一種小分子蛋白，能夠通過(guò)自分泌或旁分泌的方式，影響細(xì)胞的增殖、分化及功能活化，在人類(lèi)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［5］。EGF相關(guān)蛋白包括 EGF、TGF-a、CR、AR 和 EGFR。 EGFR 是具有配體介導(dǎo)的酪氨酸激酶活性的多功能跨膜蛋白，是定位于人第7號(hào)染色體斷臂的原癌基因C-erbB-1 的表達(dá)產(chǎn)物，分子質(zhì)量為 170 ku［5］。 EGFR 作為EGF和TGF-a的受體。通過(guò)與配體結(jié)合后獲得酪氨酸激酶活性，刺激酪氨酸激酶通路，從而促進(jìn)細(xì)胞的惡變。最近的研究表明，AR也是通過(guò)EGFR解旋活化的［6］。CR的受體目前仍不確定。

Sebastaian 等［7］指出，EGFR 至少與 33%～50%的人類(lèi)表皮腫瘤相關(guān)，是表皮腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。此外，EGFR在許多腫瘤細(xì)胞中均為高表達(dá)，包括頭頸部癌、乳腺癌、腎癌、宮頸癌和食管癌等。Livasy等［8］研究發(fā)現(xiàn)，EGFR表達(dá)陽(yáng)性的子宮內(nèi)膜癌患者的總生存時(shí)間明顯短于EGFR表達(dá)陰性的患者，表明EGFR在子宮內(nèi)膜癌的形成中具有非常重要的作用。研究還發(fā)現(xiàn)，EGFR的突變可活化不同的下游信號(hào)途徑，不同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞，其EGFR信號(hào)經(jīng)過(guò)的下游轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也不完全相同［9］。有學(xué)者［10］提出，EGER表達(dá)的上調(diào)可作為新的判斷腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的分子標(biāo)記物。

TGF-a是一種正常時(shí)在胚胎期分泌的生長(zhǎng)因子，多存在于腫瘤患者的腫瘤組織中，如肺癌、肝細(xì)胞癌、膀胱癌和乳癌等，曾被報(bào)道能預(yù)示某些癌癥患者的預(yù)后情況，如肺癌和乳腺癌等［11］。TGF-a的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。有文獻(xiàn)［6］報(bào)道，TGF-a的表達(dá)和缺失是判斷某些疾病臨床分期、子宮內(nèi)膜癌肌層浸潤(rùn)深度等的有力指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，EGF在正常和增生性子宮內(nèi)膜中表達(dá)水平較高，在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)水平低于正常及增生性子宮內(nèi)膜；TGF-a在子宮內(nèi)膜癌中的陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)66.7%，并且與癌組織的低分化水平有關(guān)。以上結(jié)果提示:EGF及TGF-a的變化在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展上有著重要的作用。

子宮內(nèi)膜上皮和乳腺上皮是雌激素主要的作用靶點(diǎn)，雌激素能夠促進(jìn)這些細(xì)胞的增殖，并與它們的癌變有關(guān)。Livasy等［8］研究發(fā)現(xiàn)，EGFR在乳腺癌中表達(dá)明顯增加，腫瘤浸潤(rùn)組高于非浸潤(rùn)組、淋巴轉(zhuǎn)移組高于非轉(zhuǎn)移組，認(rèn)為EGFR高表達(dá)與乳腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。

在靶細(xì)胞中，雌激素通過(guò)雌激素受體相結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)［12］報(bào)道，E2的免疫反應(yīng)與組織學(xué)水平和臨床分期相關(guān)，在腫瘤中EGF和EGFR的陽(yáng)性表達(dá)分別為25.6%和53.1%，這與腫瘤自身的組織學(xué)水平和臨床分期并無(wú)明顯的相關(guān)性；另一方面，TGF－a在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)率可達(dá)到67.0%，并且與組織的的低分化水平和臨床分期有關(guān)。這與本研究結(jié)果相一致。

國(guó)外 Niikyra 等［6］報(bào)道，TGF－a 與 EGFR 在癌組織中的表達(dá)存在緊密的關(guān)聯(lián)性，而EGFR和EGF之間并未檢測(cè)到明顯的相關(guān)性；EGFR、EGF、TGF－a 和CR在正常子宮內(nèi)膜和增生性子宮內(nèi)膜中都存在表達(dá)，但免疫學(xué)反應(yīng)都不強(qiáng)烈；在正常子宮內(nèi)膜和增生性子宮內(nèi)膜中，TGF－a的表達(dá)通常與ER和PR共存。這些研究表明，在正常子宮內(nèi)膜和增生性子宮內(nèi)膜中，TGF－a的表達(dá)是雌激素依賴(lài)的。有學(xué)者［13］提出，E2在正常子宮內(nèi)膜中的促有絲分裂效應(yīng)可能是通過(guò)EGF/TGF－a活化的；EGF的表達(dá)與患者的年齡有密切的關(guān)系，而子宮內(nèi)膜癌中EGFR和TGF－a的表達(dá)和缺失與其臨床分期及子宮肌層的浸潤(rùn)深度相關(guān)。有文獻(xiàn)［14－17］報(bào)道稱(chēng)，在低分化的子宮內(nèi)膜癌中TGF－a/EGFR是通過(guò)自分泌和旁分泌的方式，而不是EGF/EGFR通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌發(fā)展的，而在高分化子宮內(nèi)膜癌中，TGF－a的表達(dá)類(lèi)似于正常子宮內(nèi)膜和增生性子宮內(nèi)膜，為雌激素依賴(lài)性的。

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