蔡國平 熊敏 張新潮 劉德昌 桂柯科

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院骨科，上海 201508)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是最常見的骨關(guān)節(jié)退行性疾病，多發(fā)于老年患者。趨化因子白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES)和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2(macrophage in-flammatory protein 2，MIP-2)均參與基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的調(diào)控及OA的進(jìn)程［1］。腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)可在多種細(xì)胞中表達(dá)，是一種多功能細(xì)胞因子，具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和趨化因子分泌以及細(xì)胞增生等生物學(xué)效應(yīng)［2］。本課題組早期研究［3］顯示，TWEAK及其受體——成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)因子14(fibroblast growth factor inducible 14，F(xiàn)n14)的mRNA及蛋白表達(dá)水平在大鼠OA關(guān)節(jié)的軟骨和滑膜組織中顯著升高，它們可能是參與OA的重要細(xì)胞誘導(dǎo)因子，且TWEAK能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞中MMPs的生成。本研究旨在探討TWEAK是否能促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子，從而進(jìn)一步認(rèn)識(shí)TWEAK在OA中的具體作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠2只，8周齡，雌雄各半，體質(zhì)量(200±30)g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。大鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)的清潔級(jí)動(dòng)物房，室溫24℃，相對(duì)濕度40% ～70%，12 h光照與12 h黑暗循環(huán)照明，自由攝食、飲水。

1.2 主要試劑及儀器 0.25%胰酶(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司)，胎牛血清(美國 Gibco公司)，細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(美國Hyclone公司)，Ⅱ型膠原兔抗鼠抗體(美國Sigma公司)，羊抗兔IgG二抗/FITC標(biāo)記(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司，CKX31)，待測(cè)因子ELISA試劑盒(美國R＆D公司)，重組小鼠TWEAK/TNFSF12蛋白(美國R＆D公司)。

1.3 大鼠軟骨細(xì)胞的培養(yǎng) 以頸椎脫臼法處死大鼠，無菌條件下切取腿部，剔除膝關(guān)節(jié)周圍肌肉及其他軟組織，打開關(guān)節(jié)囊，刀片削取軟骨組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，將軟骨組織剪成1 mm3大小，37℃胰酶消化20 min;充分吹打，靜置片刻，棄上清液;將剩余組織加入4 mL 0.2%Ⅱ型膠原酶消化液，37℃消化40 min，加入適量完全培養(yǎng)基終止消化，用滴管充分吹打細(xì)胞消化液，過200目篩網(wǎng)，收集濾液，離心、棄上清液;沉淀細(xì)胞加 5 mL DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液一次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況，待貼壁鋪滿培養(yǎng)瓶，融合成片，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.4 大鼠軟骨細(xì)胞的鑒定 實(shí)驗(yàn)前1 d將細(xì)胞接種至六孔板中，待細(xì)胞匯合度約70%時(shí)染色，常規(guī)固定、通透和封閉;加入Ⅱ型膠原一抗，37℃孵育2 h，PBS洗3遍，每次5 min;加入羊抗兔IgG二抗，37℃孵育60 min，PBS洗3遍，每次5 min;加20 μL封片劑封片;鏡檢免疫熒光染色呈陽性，符合大鼠軟骨細(xì)胞特征。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力 將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞消化并稀釋至4×104個(gè)/mL，取100 μL至96孔培養(yǎng)板，以100 μL培養(yǎng)液作空白對(duì)照，37℃培養(yǎng)過夜。棄培養(yǎng)液，加不同濃度TWEAK(125、250、500 ng/mL)，培養(yǎng)24、48、72 h后行 MTT檢測(cè)。按1∶10體積比混合MTT和DMEM培養(yǎng)基，按每孔100 μL加入待測(cè)孔中，37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下孵育1 h。分光光度計(jì)測(cè)定450 nm波長處光密度D值，繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算TWEAK對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(50%inhibitory concentration，IC50)。

1.6 細(xì)胞因子刺激實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長期的軟骨細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化為單細(xì)胞懸液，顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為5×104個(gè)/mL，取1 mL接種至6孔培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)過夜，貼壁后去除培養(yǎng)液，用無血清DMEM培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組加入濃度為250 ng/mL TWEAK，對(duì)照組不加 TWEAK，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，分別收集各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.7 ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中趨化因子含量 分別檢測(cè)趨化因子RANTES、MCP-1、MIP-2和IL-8的含量，具體實(shí)驗(yàn)步驟按照酶聯(lián)免疫分析試劑盒(美國R＆D Systems)說明書完成。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TWEAK處理大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)RANTES表達(dá)的比較 選取TWEAK對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的IC50值250 ng/mL作為其給藥濃度，在250 ng/mL TWEAK處理大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞24、48、72 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液中RANTES濃度均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);且隨著TWEAK作用時(shí)間的延長，RANTES的含量也逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見圖1。

圖1 TWEAK刺激后大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中RANTES的表達(dá)變化

2.2 TWEAK處理大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)MCP-1表達(dá)的比較 實(shí)驗(yàn)組在250 ng/mL TWEAK誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞上清液中MCP-1濃度與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但TWEAK刺激48、72 h后實(shí)驗(yàn)組MCR-1濃度均顯著高于相應(yīng)對(duì)照組(P＜0.05)，隨著 TWEAK處理時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組MCP-1含量發(fā)生顯著變化(P＞0.05)。見圖2。

圖2 TWEAK刺激大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)MCP-1表達(dá)的比較

2.3 TWEAK處理大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)IL-8表達(dá)的比較 在250 ng/mL TWEAK誘導(dǎo)24 h后，實(shí)驗(yàn)組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞上清液中IL-8的表達(dá)與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但48、72 h后實(shí)驗(yàn)組均顯著高于相應(yīng)對(duì)照組(P＜0.05);隨著TWEAK處理時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組IL-8含量無顯著變化(P＞0.05)。見圖3。

圖3 TWEAK刺激大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)IL-8的表達(dá)

2.4 TWEAK處理大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)MIP-2的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在250 ng/mL TWEAK誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞上清液中MIP-2含量與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但48、72 h后實(shí)驗(yàn)組 MIP-2均明顯低于相應(yīng)對(duì)照組(P＜0.05);隨著與 TWEAK處理時(shí)間的延長，MIP-2含量均逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖4。

圖4 TWEAK刺激大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)MIP-2的表達(dá)

3 討 論

長期以來，OA一直被認(rèn)為是非炎性反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎。Oehler等［4］用關(guān)節(jié)鏡檢觀察OA患者滑膜的病理學(xué)變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，早期和晚期OA均有炎性反應(yīng)表現(xiàn)。OA炎性反應(yīng)中浸潤最多的為巨噬細(xì)胞，其產(chǎn)生的細(xì)胞因子(包括IL-1β、TNF-α等)，與OA的軟骨破壞密切相關(guān)［5］。

趨化因子是一種分泌型分子，分子量小，參與附著和趨化免疫細(xì)胞。部分趨化因子在OA中表達(dá)增加;炎性細(xì)胞因子能誘導(dǎo)OA軟骨細(xì)胞表達(dá)趨化因子，趨化因子與其相應(yīng)的受體結(jié)合后又能促進(jìn)MMPs的釋放［1］。在OA發(fā)生、發(fā)展過程中存在復(fù)雜的細(xì)胞因子相互作用網(wǎng)絡(luò)。本課題組前期研究［3］證實(shí)，TWEAK也是參與OA的重要細(xì)胞誘導(dǎo)因子，且TWEAK能促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞中MMPs水平的上調(diào)。

本研究結(jié)果顯示，TWEAK誘導(dǎo)24、48、72 h后，大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞上清液中RANTES蛋白的表達(dá)均顯著高于相應(yīng)對(duì)照組，且RANTES蛋白的表達(dá)隨TWEAK處理時(shí)間的延長逐漸增加;在誘導(dǎo)48、72 h后，實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞上清液中MCP-1蛋白表達(dá)顯著高于相應(yīng)對(duì)照組，但隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組MCP-1含量無明顯變化;TWEAK誘導(dǎo)后實(shí)驗(yàn)組IL-8的變化與MCP-1類似，但MIP-2卻截然相反，MIP-2蛋白的表達(dá)在TWEAK誘導(dǎo)48、72 h后均明顯低于相應(yīng)對(duì)照組，且隨著TWEAK誘導(dǎo)時(shí)間的延長，MIP-2含量逐漸減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示，TWEAK能夠誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中趨化因子(RANTES、MCP-1和IL-8)的產(chǎn)生或誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生MMPs，TWEAK通過誘導(dǎo)此類趨化因子的產(chǎn)生間接促進(jìn)OA的發(fā)展。然而，TWEAK誘導(dǎo)后，MIP-2的產(chǎn)生反而減少，且其含量的下降與誘導(dǎo)時(shí)間有明顯相關(guān)性，推測(cè)MIP-2在OA病程中可能起到抑制作用。

有研究［6］通過抑制 IL-1β 和 TNF-α 等細(xì)胞因子，試圖控制OA，但結(jié)果不理想，說明在OA病理機(jī)制中還存在諸多其他細(xì)胞因子，刺激MMPs的合成與分泌，最后促進(jìn)軟骨組織的降解。TWEAK即為其中之一，它能直接誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞產(chǎn)生 MMPs。結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)TWEAK可能通過誘導(dǎo)趨化因子的產(chǎn)生，間接促進(jìn)MMPs的表達(dá)并抑制軟骨蛋白聚糖的合成等，從而導(dǎo)致OA。本研究為進(jìn)一步探討TWEAK在OA發(fā)病機(jī)制中的作用以及OA的治療提供了理論依據(jù)。

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