潘奇 陳萬勇 朱凱 張巨波 趙一鳴 朱小東 孫惠川 王魯 任寧

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科，上海 200032)

在腫瘤病死原因中，原發(fā)性肝癌已居世界第3位、中國第2位［1-2］。前期的動物研究［3］發(fā)現(xiàn)，干擾素α可顯著地抑制肝癌的生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā);之后的臨床隨機對照試驗［4］也證實干擾素α可以減少和推遲肝癌切除術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，但具體的調(diào)控機制仍不清楚。轉(zhuǎn)錄因子Sp1(specificity protein 1)是序列特異性的DNA結(jié)合蛋白，參與調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄［5］。近年來研究［6-7］發(fā)現(xiàn)，Sp1 在腫瘤組織中有異常表達和活化。本研究采用蛋白免疫印跡(Western blotting，WB)法和凝膠電泳遷移率變動分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)法研究干擾素α對肝癌細胞內(nèi)Sp1的表達及活性的影響，以探討干擾素α治療肝癌的可能機制。

1 資料與方法

1.1 細胞株 人肝癌細胞系MHCC97H由復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所保存和培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco-BRL公司)，特級胎牛血清(40 nm過濾，美國Hyclone公司)，0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA 消化液(美國Difco公司)。干擾素α1b(深圳科興生物工程有限公司);細胞總蛋白和核蛋白抽提試劑盒(美國Panomics公司);蛋白濃度檢測試劑盒(Bradford法，上海申能博彩生物科技有限公司);EMSA combo試劑盒(美國Panomics公司);Western blotting試劑盒(美國 Millipore公司);大鼠抗人 Sp1(PEP2，sc59)多克隆抗體(美國Santa Cruz公司);大鼠抗人磷酸化Sp1(Thr739)多克隆抗體(美國Centre Antoine公司);辣根過氧化物酶標記的羊抗大鼠IgG(上?？党缮锕こ逃邢薰?。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)、細胞總蛋白及核蛋白抽提 MHCC97H細胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，每隔3～5 d傳代1次。將對數(shù)生長期的MHCC97H細胞分為5組，各組細胞分別用不含干擾素的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液及分別含干擾素5、10、30、50 ng/mL的無血清 DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)20 min，進行后續(xù)實驗。按照試劑盒說明抽提細胞總蛋白及核蛋白，采用Bradford法測定蛋白濃度。

1.3.2 EMSA法檢測干擾素α對Sp1活性的影響凝膠寡核苷酸探針(生物素標記)序列如下:Sp1上游引物:5'-ATTCGATCGGGGCGGGGCGAGC-3';下游引物:5'-GCTCGCCCCGCCCCGATCGAT-3'。參照EMSA combo試劑盒說明進行操作，將細胞核蛋白抽提物(5μg)與生物素標記的凝膠寡核苷酸探針(10 ng)在20℃條件下反應(yīng)30 min，反應(yīng)混合物經(jīng)6%非變性聚丙烯酰胺凝膠在0.5Tris-硼酸電泳緩沖液中電泳3 h(溫度4℃，電壓120V)。用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移于尼龍膜上。用GEA封閉液室溫下封閉尼龍膜40 min后加入用緩沖液稀釋的堿性磷酸酶耦聯(lián)的鏈親和素，室溫震搖10 min，加化學(xué)發(fā)光底物后室溫孵育2 min，在暗室中曝光于X線膠片。

1.3.3 Western blotting法檢測 Sp1的表達及磷酸化程度 取20 mL總蛋白經(jīng)12% 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，用 5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Sp1一抗，4℃孵育過夜，次日用洗膜緩沖液TBST洗膜后加入熒光標記的二抗(1∶10 000稀釋)，室溫孵育1 h。

2 結(jié) 果

2.1 干擾素α對Sp1活性的影響 干擾素α可明顯下調(diào)MHCC97H細胞中Sp1的活性，并呈劑量依賴性。見圖1。

2.2 干擾素α對Sp1蛋白含量和磷酸化水平的影響 干擾素α下調(diào)MHCC97H細胞中Sp1蛋白的表達及磷酸化水平，并呈劑量依賴性。見圖2。

圖1 干擾素α對MHCC97H細胞中Sp1活性的影響

圖2 干擾素α對MHCC97H細胞中Sp1蛋白表達及磷酸化水平的影響

3 討 論

肝癌根治術(shù)后5年的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率為60%～70%［2］。干擾素α能降低肝癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，提高患者的總生存率［4］，對其他腫瘤也有類似效果［8-9］，但干擾素降低腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用機制，目前尚不明了。

一般認為，Sp1可能參與腫瘤發(fā)展、增殖和轉(zhuǎn)移。目前對Sp1的相關(guān)研究多集中在蛋白或基因水平。Yao等［5］發(fā)現(xiàn)，Sp1在胃癌細胞核內(nèi)呈高表達，在正常胃黏膜細胞呈低表達或無表達。Shi等［6］發(fā)現(xiàn)，胰腺癌中Sp1異?；罨蓪?dǎo)致血管內(nèi)皮生成因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等下游基因過表達，增強腫瘤血管的生成效應(yīng)，從而促進腫瘤的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移。

本研究采用EMSA法檢測干擾素α對Sp1活性的影響，結(jié)果顯示，干擾素α能明顯降低Sp1的活性，并呈劑量依賴性。此外，Sp1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性還受蛋白翻譯后修飾(如磷酸化、糖基化)等的調(diào)控［10-12］。本研究采用Western blotting法檢測干擾素α對Sp1蛋白表達和磷酸化水平的影響，結(jié)果顯示，干擾素α明顯下調(diào)Sp1在肝癌細胞MHCC97H細胞核內(nèi)的含量和磷酸化程度，并呈劑量依賴性，以Sp1蛋白磷酸化水平下調(diào)更為明顯。

研究［13］證實，干擾素抗肝癌的主要機制是抑制肝癌的血管生成，進而抑制肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移;而Sp1與VEGF啟動子特異性結(jié)合是VEGF轉(zhuǎn)錄調(diào)控最重要的機制［14］;本研究發(fā)現(xiàn)，干擾素可調(diào)節(jié)Sp1的活性、表達及磷酸化程度。由此判斷，Sp1可用于預(yù)測干擾素α抗肝癌的臨床療效。

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