劉永安，潘彬榮，岳高紅，梅喜雪，許立奎，張宗宸，周志輝

（1. 浙南作物育種重點實驗室溫，浙江 溫州325006；2. 溫州市農業(yè)科學研究院，浙江 溫州325006）

分子標記是研究小麥遺傳和育種的重要技術手段，既可以研究小麥種質資源的遺傳多樣性，又可以對農藝性狀進行輔助選擇，具有不受時間限制、針對性強、效率高等優(yōu)點。通常，用于分子標記的DNA 是從小麥的幼葉中提取的。在研究過程中，雖然可以隨時萌發(fā)種子獲取幼葉用以提取DNA，但小麥的生長受一定季節(jié)的限制。如果沒有溫室等設施，在不適宜小麥播種的季節(jié)進行分子標記輔助選擇，選擇出的目標植株將不能正常生長，甚至不能獲得種子，而這些設施正是一些基層科研單位所缺少的。而從遠離小麥胚的半粒種子中提取DNA 是解決該問題的有效途徑。從半粒種子中提取的DNA 用于分子標記，剩下的半粒種子可適時播種，不需借助溫室等設施。

目前，小麥種子DNA 的提取已有較多報道[1-2]。在提取的過程中，通常會用到苯酚、氯仿、異戊醇等試劑。然而，氯仿受公安部門管制，購買時需要公安部門審批[3]，對一些基層科研單位，購買氯仿不但相對困難，而且還比較費時。因此，研究嘗試探索一種不用氯仿的小麥籽粒DNA 提取的簡單方法，以便為基層科研單位進行小麥分子標記提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以含有Pm21 基因的揚麥18 為研究對象，該材料從江蘇省里下河地區(qū)農業(yè)科學院引進。主要試驗試劑有Tris、濃鹽酸、EDTA、SDS、NaCl、乙醇、醋酸銨等，以上試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥幼葉DNA 提取 參考柴建芳等[4]的方法提取，但最后不加RNA 酶，該法提取的DNA 作為從籽粒提取DNA 的對照。

1.2.2 有氯仿小麥籽粒DNA 提取 參考董建力等的方法進行提取，該法提取的DNA 作為無氯仿小麥籽粒提取DNA 的對照。

1.2.3 無氯仿小麥籽粒DNA 提取 用刀片切取半粒小麥種子（有胚和無胚），置于1 張干凈稱量紙上，將稱量紙對折以便使小麥籽粒留于中間；用研棒將籽粒研碎，移于1.5 mL 離心管中；加入700 μL DNA 提取緩沖液（100 mmol/L Tris·HCl pH 8.0，50 mmol/L EDTA，500 mmol/L NaCl，2%SDS），65℃水浴約30 min，其間搖勻數次；冷卻至室溫，于4℃下13 000 rpm 離心15 min；取500 μL 上清液于一新的1.5 mL 離心管中，加入50 μL 10 mol/L 醋酸銨和1 mL 95%乙醇，上下顛倒7～8 次，于4℃下13 000 rpm 離心10 min；棄上清液，加入500 μL 70%乙醇，上下顛倒7～8 次，于4℃下13 000 rpm 離心2 min；棄上清液，于37℃恒溫箱中干燥1 h；加50 μL TE緩沖液溶解DNA。

1.2.4 DNA 質量檢查 取2 μL DNA 樣品與1 μL 6×DNA Loading Buffer 混合，于1%瓊脂糖凝膠（含EB）上電泳15 min 檢查DNA 質量。

1.2.5 PCR 檢測 用多重PCR 檢測揚麥18 的3個Wx蛋白亞基（Wx-A1、Wx-B1 和Wx-D1）基因和抗白粉病基因Pm21，其反應體系及擴增條件參考許立奎等[5]的方法，引物序列及預擴增條帶見表1。

表1 引物序列及其預擴增片段

2 結果與分析

2.1 DNA 質量檢測

由圖1 可知，3種提取方法都能得到DNA 條帶，但不同方法所取得的DNA 量有所不同，從葉片中提取的和用氯仿提取的DNA 濃度較高，沒有用氯仿提取的DNA 濃度較低。同時，有研究表明不同提取方法和小麥籽粒不同部位提取RNA 的濃度有顯著差異，從葉片中提取的和從有胚半粒小麥種子中提取的RNA 的濃度較高，從無胚半粒小麥種子提取RNA 的濃度較低。另外，從葉片中提取的RNA 片段較小，用有氯仿方法從有胚半粒種子提取的RNA 片段較大，而用無氯仿方法從有胚半粒種子提取RNA 片段呈現(xiàn)較為均勻的彌散狀態(tài)。

圖1 小麥籽粒不同提取方法DNA 凝膠電泳圖譜

2.2 多重PCR 檢測

如圖2 所示，用各種方法提取的DNA 進行擴增，基本都能得到目標條帶Wx-D1（204 bp）、Wx-A1（265 bp）、Wx-B1（854 bp）和Pm21（1 400 bp），但其多重PCR 結果有明顯差異，主要表現(xiàn)在目標條帶Wx-D1（204 bp）和Pm21（1 400 bp）亮度的差異。從葉片中提取的DNA 擴增效果最好，各目標條帶都較亮；用氯仿提取的半粒種子DNA 擴增效果稍差，泳道2（有氯仿有胚半粒提取DNA）的Wx-D1（204 bp）條帶不明顯；沒有用氯仿提取的半粒種子的DNA 擴增效果也較差，從有胚和無胚半粒種子提取DNA 擴增的Pm21（1 400 bp）都較暗，這可能與模板DNA 濃度較低有關。

圖2 不同DNA 樣品多重PCR 擴增結果凝膠電泳圖譜

3 討論

研究所用的無氯仿小麥籽粒DNA 提取方法，與以前的研究相比，所需試劑沒有氯仿，操作步驟少了“氯仿-異戊醇或苯酚-氯仿-異戊醇抽提”這一環(huán)節(jié)，具有所需試驗試劑容易獲取、操作步驟簡單快捷等優(yōu)點。與傳統(tǒng)的氯仿提取方法相比，雖然該方法所得的DNA 濃度較低，但一樣可用作PCR 擴增模板。

該研究用多重PCR 進行檢測，與一般PCR 相比，具有所需試劑少、通量高、經濟等優(yōu)點[9]，但也存在對模板DNA 質量要求高、引物設計困難、不同擴增片段存在競爭等問題[10]。用無氯仿提取法所得到DNA 為模板，可擴增出所有目標條帶，說明該DNA 提取方法具有較好的實用性。不過，用該方法提取的DNA 為模板，所擴增出的Pm21（1 400 bp）條帶較暗，需增加上樣量或用聚丙稀酰胺凝膠電泳檢測，以得到更為理想的效果。因此，無氯仿小麥籽粒DNA 提取方法可在對DNA 質量要求不高以及氯仿無法及時得到時使用，尤其適合基層科研單位使用。

[1]董建力，張增艷，王敬東，等.用于PCR分析的小麥種子DNA微量快速提取[J].種子，2007，26（5）：10-12.

[2]任 強，張增艷，黃 鵬.半粒小麥種子DNA提取的研究[J].甘肅農業(yè)大學學報，2010，45（4）：59-62.

[3]苗翠英，張 晶.論走私、販賣易制毒化學品案件的特點及防范對策[J].公安大學學報，2002，（1）：92-96.

[4]柴建芳，劉 旭，賈繼增.一種適于PCR擴增的小麥基因組DNA快速提取法[J].植物遺傳資源學報，2006，7（2）：246-248.

[5]許立奎，潘彬榮，岳高紅，等.抗白粉病糯性小麥的多重PCR分子鑒定技術[J].核農學報，2014，28（7）：1203-1207.

[6]Shariflou M R，Sharp P J.A polymorphicmicrosatellite in the 3’end of‘waxy’genes ofwheat，Triticum aestivum[J].Plant Breeding，1999，118（3）：275-277.

[7]劉迎春.小麥Wx基因的分子標記及其應用[D].南京：南京農業(yè)大學，2004.

[8]Liu Z，Sun Q，Ni Z，et al.Development of SCAR markers linked to the Pm21 gene conferring resistance to powderymildew in common wheat[J].PlantBreeding，1999，118（3）：215-219.

[9]陳明潔，方 倜，柯 濤，等.多重PCR——一種高效快速的分子生物學技術[J].武漢理工大學學報，2005，27（10）：33-36.

[10]黃銀花，胡曉湘，徐慰倬，等.影響多重PCR擴增效果的因素[J].遺傳，2003，25（1）：65-68.