宣慧娟 李 利 白明艷 孫云峰 萬 平 楊志偉

（首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100048）

生物體輻射抗性的機(jī)理一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。耐輻射奇異球菌(Deinococcus radiodurans)是迄今發(fā)現(xiàn)的具有極強(qiáng)輻射抗性的微生物之一，對(duì)其輻射抗性機(jī)制的研究也最為透徹[1-5]。迄今為止，大量研究主要集中在DNA修復(fù)能力方面[6-8]。近年來，Daly 等[9-10]認(rèn)為抗氧化保護(hù)是輻射抗性的關(guān)鍵因素。這一假說提出電離輻射可以導(dǎo)致水光解，產(chǎn)生的活性氧自由基(ROS)會(huì)損傷核酸、蛋白質(zhì)和脂類等生物大分子。因此推測(cè)有機(jī)體抗氧化能力的高低決定了其輻射生存率。在耐輻射奇異球菌中，研究表明Mn復(fù)合物是ROS的有效清除劑，但不同生物體可能具有不同的輻射抗性機(jī)制[11]。

芽胞桿菌也存在輻射抗性現(xiàn)象。蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)的表面S-層蛋白可賦予細(xì)胞更強(qiáng)的輻射抗性[12]?？莶菅堪麠U菌(Bacillus subtilis)的非同源末端連接(NHEJ)參與了輻射后DNA的修復(fù)[13]。在巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)等其它芽胞桿菌中，電離輻射可以影響多個(gè)細(xì)胞代謝途徑，包括DNA重組、蛋白質(zhì)更新和脅迫響應(yīng)機(jī)制等[14-18]。但目前對(duì)芽胞桿菌輻射抗性機(jī)理的研究還十分有限。

芽胞桿菌T61(Bacillus sp. T61)是從西藏土樣中分離得到的一株具有較強(qiáng)輻射抗性的菌株。本研究測(cè)定了該菌株對(duì)γ-射線的輻射抗性，并研究了γ-射線輻照后芽胞桿菌T61在蛋白質(zhì)組水平發(fā)生的變化，以期發(fā)現(xiàn)細(xì)菌輻射抗性的新機(jī)制，拓展對(duì)生物體輻射抗性的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)條件

本研究所用菌株為芽胞桿菌 T61，來自西藏岡巴拉山土樣，由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。對(duì)照菌株 D.radiodurans (CGMCC 1.633) 購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，E. coli K12由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院張維研究員饋贈(zèng)。芽胞桿菌T61和耐輻射奇異球菌用TGY培養(yǎng)基(0.5%胰蛋白胨、0.3%酵母提取物、0.1%葡萄糖)30 ℃培養(yǎng)，E. coli K12用LB培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl) 37 ℃培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

B-PER 細(xì)菌總蛋白抽提試劑盒(Thermo scientific)；雙向電泳相關(guān)試劑(GE healthcare)；Ultrospec 3100 pro 紫外可見分光光度計(jì)(GE healthcare)；Ettan IPGphor 3 等電聚焦儀(GE healthcare)；垂直電泳儀(BIO-RAD)；ImageScanner III 掃描儀(GE healthcare)；4800 Plus MALDI TOF/TOFTMAnalyzer (ABI)；60Co γ-射線射源（北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系鈷源室）。

1.3 芽胞桿菌T61的γ-射線輻射抗性的分析

將芽胞桿菌T61菌株接種于TGY培養(yǎng)基中，于30 ℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)早期(A600=0.3-0.4)。離心收集菌體，用0.1 mol·L-1的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)洗一次，并重新懸浮于等體積的磷酸鉀緩沖液中。取1.5mL 菌液加到1.5mL EP 管中，室溫下(10- 20 ℃)進(jìn)行60Co γ-射線輻照（劑量率 10 Gy·min-1)，輻射劑量分別為2、4、6、8和10 kGy。輻射后，分別用0.1 mol·L-1磷酸鉀緩沖液適當(dāng)稀釋，取稀釋液涂布于TGY平板，30 ℃培養(yǎng)。計(jì)算輻射存活率。以對(duì)數(shù)早期D. radioduran 和E. coli K12細(xì)胞為對(duì)照。

1.4 輻射處理和細(xì)胞可溶性蛋白的提取

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)早期(A600=0.3-0.4)的芽胞桿菌T61菌液分為兩部分，一部分進(jìn)行10 kGy60Co γ-射線輻射，另一部分作為對(duì)照，同樣條件下放置，未經(jīng)輻射。輻射后離心收集菌體，-20 ℃儲(chǔ)存。

處理組（γ-射線輻射）和對(duì)照組（未輻射）菌體各3g，分別懸浮于適當(dāng)體積的B-PER? Reagent(Pierce)中，補(bǔ)加 0.2 μmol·mL-1PMSF 和 200 μg·mL-1溶菌酶，輕微搖動(dòng) 20 min。4 ℃ 15000g離心15 min，上清液轉(zhuǎn)移至新管，加入1.2倍體積的Tris飽和酚，冰上渦旋20 min。4 ℃ 20000g離心20 min，酚相（下相）轉(zhuǎn)移至新管，加入5倍體積0.1 mol·L-1乙酸銨（甲醇配制），混勻，-20 ℃靜置2 h。4 ℃ 20000g離心10 min，沉淀用無水乙醇和丙酮（含0.07% β-巰基乙醇）各洗一次，冷凍干燥，-20℃保存。

1.5 雙向電泳分離蛋白質(zhì)

將蛋白質(zhì)樣品溶于適量上樣緩沖液(8 mol·L-1Urea, 2% CHAPS, 50 mmol·L-1DTT 和 0.5% IPG buffer pH=4-7)中，采用 Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。按照生產(chǎn)廠商(GE Healthcare)的使用說明進(jìn)行雙向電泳分析。首先取340 μL樣品（含800 μg蛋白）加入水化盤中，放入18 cm的膠條 (18 cm, pH 4-7)，水化18 h。水化結(jié)束后，采用Ettan IPGphor III進(jìn)行等電聚焦，聚焦程序?yàn)?50 V，3 h；500 V，2 h；1000 V，1 h；10000 V，3 h；10000 V，100000 Vh；500 V，20 h。聚焦完畢，平衡后進(jìn)行第二向SDS-PAGE，分離膠濃度為 12.5%。用考馬斯亮藍(lán)G-250染液染色過夜，次日進(jìn)行脫色。將脫色后的凝膠用ddH2O清洗，采用ImageScanner III 掃描儀進(jìn)行圖像采集，用BIO-RAD PDQuestTM2-D Analysis Software 8.0.1對(duì)圖像進(jìn)行分析。

處理組和對(duì)照組分別提取了3次蛋白質(zhì)樣品，每個(gè)樣品至少進(jìn)行2次雙向電泳分離。從凝膠上切取表達(dá)量發(fā)生2倍以上變化的蛋白質(zhì)樣點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.6 質(zhì)譜分析和差異蛋白的數(shù)據(jù)庫查詢

差異蛋白送交上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析。采用MASCOT搜索軟件在NCBI非冗余庫 (NCBInr) 中進(jìn)行肽譜比對(duì)，根據(jù)蛋白質(zhì)得分(C. I. % >95%)、肽段的匹配數(shù)目(≥5)和序列覆蓋度(>15%)等評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)鑒定的可靠性。

2 結(jié)果與討論

2.1 芽胞桿菌T61的γ-射線輻射抗性分析

芽胞桿菌T61對(duì)γ-射線的輻射抗性遠(yuǎn)高于對(duì)照菌株大腸桿菌K12。在本實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)輻射劑量為 1 kGy時(shí)，大腸桿菌 K12的生存率接近于0.0001%，而T61的生存率約為40%。隨著輻射劑量的增加，T61存活率下降，D10為4 kGy。當(dāng)輻射劑量為10 kGy時(shí)，存活率為0.002%，比耐輻射奇異球菌低100倍（見圖1）。

圖1 芽胞桿菌T61 γ-射線輻照后的存活曲線Fig.1 Survival curves of strain Bacillus sp. T61 after γ-ray irradiation

2.2 γ-射線輻射后芽胞桿菌T61蛋白組的變化

對(duì)處理組（γ-射線輻射）和對(duì)照組（未輻射）可溶性蛋白進(jìn)行雙向電泳分析，代表性電泳圖譜如圖2所示。在每塊膠上可分離得到900多個(gè)蛋白點(diǎn)，這些蛋白點(diǎn)主要集中在分子量20-100 kDa，pH4-7的范圍內(nèi)。與未經(jīng)輻射的蛋白質(zhì)樣品相比，10kGy60Co γ-射線輻射后至少有 30個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)出現(xiàn)顯著變化。其中22個(gè)蛋白點(diǎn)上調(diào)為輻射前的兩倍以上，8個(gè)蛋白點(diǎn)下調(diào)為輻射前的二分之一以下。

圖2 輻照前(a)后(b)芽胞桿菌T61的蛋白質(zhì)組圖譜Fig.2 Protein profile of Bacillus sp. T61 cells before (a) and after (b) irradiation

根據(jù)雙向電泳的分析結(jié)果，對(duì)輻射后發(fā)生顯著變化的 30個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行 MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，鑒定結(jié)果如表1所示。其中有4個(gè)蛋白點(diǎn)(2203,3202, 4601, 6101)含有兩種蛋白，因此30個(gè)蛋白點(diǎn)包括34種蛋白質(zhì)，其中25個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)，9個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)。進(jìn)一步根據(jù)NCBI 蛋白相鄰類的聚簇分析(Cluster of orthologous groups of proteins, COGs)對(duì)這些差異蛋白質(zhì)進(jìn)行了分類，它們分屬信息貯存和加工、細(xì)胞過程和信號(hào)、代謝和未鑒定蛋白四大類，主要涉及細(xì)胞的抗氧化防御、核苷酸代謝、能量代謝、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)的翻譯和更新等過程。

在這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中，引人注目的是，一大組抗氧化酶類在輻射后上調(diào)表達(dá)，包括醛-酮還原酶（蛋白點(diǎn)2308和5406)、巰基過氧化物酶（蛋白點(diǎn)2105)、烷基過氧化氫還原酶（蛋白點(diǎn)1201）、Mn-超氧化物歧化酶（蛋白點(diǎn)3202）和硝基還原酶家族蛋白（蛋白點(diǎn)3202）等（圖3）。在耐輻射奇異球菌中也觀察到超氧化物歧化酶(SOD)等在輻射后表達(dá)量增加[19]。本研究首次發(fā)現(xiàn)醛-酮還原酶(AKR)在輻射后顯著上調(diào)表達(dá)。由于醛-酮還原酶是一種NAD(P)H依賴型的氧化還原酶類，可以催化多種脂肪族和芳香族醛、酮類物質(zhì)的還原[20]，我們推測(cè)醛-酮還原酶可能參與了輻射后脂類過氧化物的解毒過程，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

在對(duì)抗輻射導(dǎo)致的氧化脅迫方面，除抗氧化酶類上調(diào)之外，一些可以減少活性氧自由基生成的酶類也發(fā)生了變化。琥珀酸脫氫酶（蛋白點(diǎn)8802）在輻射后上調(diào)5.2倍， 該酶氧化還原中心的有效排列可以使電子快速轉(zhuǎn)移給泛醌，從而減少了電子傳遞過程中自由基的產(chǎn)生[21]。亞硫酸還原酶β-亞基（蛋白點(diǎn) 8806）和 4-羥基-3-甲丁基-2-烯-1-基-二磷酸合成酶(GcpE，蛋白點(diǎn) 8504）分別具有一個(gè)[4Fe-4S]簇，該鐵硫簇容易受到O2·-和 H2O2的攻擊，繼而產(chǎn)生羥基自由基(·OH)[22-23]。輻射后亞硫酸還原酶β-亞基和GcpE下調(diào)，從而可以進(jìn)一步減少輻射后自由基的生成。

輻射后芽胞桿菌T61下調(diào)有氧氧化途徑，而以酵解為獲得能量的主要方式，這一點(diǎn)與耐輻射奇異球菌十分相似[3]。輻照后，可以觀察到參與酵解途徑的一些酶類，例如磷酸丙糖異構(gòu)酶（蛋白點(diǎn)1308）和果糖-1,6-二磷酸醛縮酶（蛋白點(diǎn)3301）和乳酸脫氫酶（蛋白點(diǎn)7401）上調(diào)表達(dá)，而三羧酸循環(huán)(TCA)酶類，例如丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E3（蛋白點(diǎn)4805）和丙酮酸脫氫酶E1α亞基（蛋白點(diǎn)8503）下調(diào)表達(dá)。此外，芽胞桿菌還可能利用細(xì)胞內(nèi)其它代謝物獲得能量，例如丁醇脫氫酶（蛋白點(diǎn)3503）和聚羥基烷酸合酶（蛋白點(diǎn)2203）在輻射后上調(diào)，二者分別參與丁醇[24]和聚羥基烷酸(PHAs)[25]的代謝。

表1 γ-射線輻射后芽胞桿菌T61差異蛋白質(zhì)的功能注釋Table 1 Functional annotation of the cellular proteins changed in Bacillus sp. T61 after γ-ray irradiation

續(xù)表

圖3 γ-射線輻照后表達(dá)量增加的抗氧化酶類（局部放大圖）未輻照(a)；輻照后(b)；從左至右：蛋白點(diǎn)1201, 2105, 2308, 3202, 5406Fig.3 Zoomed view of antioxidation enzymes enhanced by γ-ray irradiation

輻射后細(xì)胞除抵抗氧化脅迫外，還需要修復(fù)DNA損傷。本研究發(fā)現(xiàn)5種參與核苷酸代謝的酶類在輻照后上調(diào)，包括磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶（蛋白點(diǎn)2302）、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（蛋白點(diǎn)7607和8601）、前咕啉-8X甲基變位酶（蛋白點(diǎn)8203）、腺苷酸激酶（蛋白點(diǎn)5203）和鳥苷酸激酶（蛋白點(diǎn)2203和 4201）。其中絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶和鳥苷酸激酶分別具有兩種亞型，其分子量相同，但等電點(diǎn)發(fā)生變化，暗示出輻射過程中可能發(fā)生了蛋白質(zhì)修飾。

輻射后轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)也發(fā)生了一些變化。轉(zhuǎn)錄延伸因子GreA（蛋白點(diǎn)1103）、核糖體再循環(huán)因子（蛋白點(diǎn) 8101）和多肽脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPI)親環(huán)蛋白型（蛋白點(diǎn) 6101）在輻射后上調(diào)。在D.radiodurans也觀察到轉(zhuǎn)錄延伸因子和PPI在輻射后表達(dá)量增加[19,26-27]。觸發(fā)因子（蛋白點(diǎn) 1802）是PPI家族的成員[28]，在輻射后下調(diào)。翻譯延伸因子EFTu（蛋白點(diǎn)2603）也出現(xiàn)下調(diào)。但在D.radiodurans和其它Bacillus的輻射后恢復(fù)生長中，EFTu是上調(diào)表達(dá)的[29-30]，推測(cè)EFTu 在輻射過程中被降解，但可能在細(xì)胞恢復(fù)生長中被重新合成。

在蛋白質(zhì)的降解方面，研究表明 Clp 蛋白酶（蛋白點(diǎn)8903）下調(diào)，而肽酶T（蛋白點(diǎn)2501）上調(diào)，推測(cè)不同類型的蛋白酶可能參與了輻射后受損蛋白質(zhì)的降解。

無機(jī)離子和有機(jī)小分子在輻射抗性中的作用日益受到重視。在D.radiodurans中，Mn(II)-復(fù)合物可以清除輻射產(chǎn)生的自由基[11]。在 Halobacterium NRC-1中，高濃度的Br-可以增強(qiáng)細(xì)胞輻射抗性[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，一種功能未知的蛋白，YrhD-類似蛋白（蛋白點(diǎn)6101）在輻射后顯著上調(diào)表達(dá)。在巨大芽胞桿菌中，這一基因兩側(cè)是 modA (編碼鉬 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)和yrhE（編碼鉬氧化還原酶家族蛋白）[32]，暗示出 YrhD-類似蛋白可能參與鉬代謝，其與輻射抗性的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

芽胞桿菌 T61是一種具有較強(qiáng)輻射抗性的菌株，在10 kGy γ-射線輻射后，芽胞桿菌T61蛋白質(zhì)組發(fā)生了以下變化：(1)多種類型抗氧化酶在輻射后上調(diào)，推測(cè)抗氧化保護(hù)在T61輻射抗性中發(fā)揮關(guān)鍵作用；(2)輻射過程中，細(xì)胞主要通過酵解或利用其它代謝物獲得能量；(3)核苷酸從頭合成途徑的上調(diào)有利于促進(jìn)DNA的修復(fù)；(4)轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)的啟動(dòng)以保證受損蛋白質(zhì)的修復(fù)和新蛋白質(zhì)的再合成。圖4概括了芽胞桿菌T61細(xì)胞蛋白質(zhì)組在60Co γ-輻射過程中所發(fā)生的主要變化。

本研究首次發(fā)現(xiàn)醛-酮還原酶在輻射后顯著上調(diào)。由于醛-酮還原酶超家族可以催化脂類物質(zhì)過氧化形成的醛類物質(zhì)的還原，因而在輻射后的抗氧化保護(hù)中發(fā)揮重要作用。我們目前正在進(jìn)行醛-酮還原酶基因缺失突變體的構(gòu)建和功能分析，初步研究結(jié)果表明醛-酮還原酶基因的缺失可使菌株的輻射抗性降低，相關(guān)生物學(xué)功能的分析正在進(jìn)行中。

圖4 γ-射線輻照后芽胞桿菌T61細(xì)胞蛋白質(zhì)組變化圖解Fig.4 Main change scheme of cellular proteins in Bacillus sp. T61 after γ-ray irradiation

致謝感謝崔素霞教授在蛋白質(zhì)組學(xué)分析方面給予的建議和指導(dǎo)。感謝北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系鈷源室為60Co γ-射線輻照處理提供的幫助。

1 Krisko A, Radman M. Biology of extreme radiation resistance: the way of Deinococcus radiodurans [J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2013, 5(7):a012765.

2 Cox M M, Battista J R. Deinococcus radiodurans-the consummate survivor [J]. Nature Review Microbiology,2005, 3(11): 882-892.

3 Slade D, Radman M. Oxidative stress resistance in Deinococcus radiodurans [J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2011, 75(1): 133-191.

4 Misra H S, Rajpurohit Y S, Kota S. Physiological and molecular basis of extreme radioresistance in Deinococcus radiodurans [J]. Current Science, 2013, 104(2): 194-205.

5 Luan H, Meng N, Fu J, et al. Genome-wide transcriptome and antioxidant analyses on gamma-irradiated phases of Deinococcus radiodurans R1 [J]. PLoS One, 2014, 9(1):e85649.

6 Zahradka K, Slade D, Bailone A, et al. Reassembly of shattered chromosomes in Deinococcus radiodurans [J].Nature, 2006, 443(7111): 569-573.

7 Slade D, Lindner A B, Paulg, et al. Recombination and replication in DNA repair of heavily irradiated Deinococcus radiodurans [J]. Cell, 2009, 136(6): 1044-1055.

8 de la Tour C B, Passot F M, Toueille M et al.Comparative proteomics reveals key proteins recruited at the nucleoid of Deinococcus after irradiation-induced DNA damage [J]. Proteomics, 2013, 13(23-24): 3457-3469.

9 Daly M J. A new perspective on radiation resistance based on Deinococcus radiodurans [J]. Nature Review Microbiology, 2009, 7(3):237-245.

10 Daly MJ. Death by protein damage in irradiated cells [J].DNA Repair, 2012, 11(1):12-21.

11 Culotta V C, Daly M J. Manganese complexes: diverse metabolic routes to oxidative stress resistance in prokaryotes and yeast [J]. Antioxidants & Redox Signaling, 2013, 19(9): 933-944.

12 Kotiranta A K, Ito H, Haapasalo M P, et al. Radiation sensitivity of Bacillus cereus with and without a crystalline surface protein layer [J]. FEMS Microbiology Letters, 1999, 179(2): 275-280.

13 Moeller R, Stackebrandt E, Reitzg, et al. Role of DNA repair by nonhomologous-end joining in Bacillus subtilis spore resistance to extreme dryness, mono- and polychromatic UV, and ionizing radiation [J]. Journal of Bacteriology, 2007, 189(8): 3306-3311.

14 Granger A C, Gaidamakova E K, Matrosova V Y, et al.Effects of Mn and Fe levels on Bacillus subtilis spore resistance and effects of Mn2+, other divalent cations,orthophosphate, and dipicolinic acid on protein resistance to ionizing radiation [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(1): 32-40.

15 Ghosh S, Ramirez-Peralta A, Gaidamakova E, et al.Effects of Mn levels on resistance of Bacillus megaterium spores to heat, radiation and hydrogen peroxide [J].Journal of Applied Microbiology, 2011, 111(3): 663-670.

16 Gupta A K, Pathak R, Singh B, et al. Proteomic analysis of global changes in protein expression during exposure of gamma radiation in Bacillus sp HKG 112 isolated from saline soil [J]. Journal of Microbiology and Biotechnology,2011, 21(6): 574-581.

17 Yazdani M, Naderi-Manesh H, Khajeh K, et al. Isolation and characterization of a novel gamma-radiation-resistant bacterium from hot spring in Iran [J]. Journal of Basic Microbiology, 2009, 49(1): 119-127.

18 Yazdani M, Naderi-Manesh H. Comparative proteomics analysis of a novel γ-radiation-resistant bacterium wild-type Bacillus megaterium strain WHO DQ973298 recovering from 5 kGy γ-irradiation [J]. Iranian Journal of Biotechnology, 2012, 10(2): 96-105.

19 Basu B, Apte S K. Gamma radiation induced proteome of D radiodurans primarily targets DNA repair and oxidative stress alleviation [J]. Molecular and Cellular Proteomics,2012, 11(1): M111. 011734

20 Mindnich R D, Penning T M. Aldo-keto reductase (AKR)superfamily, genomics and annotation [J]. Human Genomics, 2009, 3(4): 362-370.

21 Yankovskaya V, Horsefield R, T?rnroth S, et al.Architecture of succinate dehydrogenase and reactive oxygen Species generation [J]. Science, 2003, 299(5607):700-704.

22 Crane B R, Siegel L M, Getzoff E D. Structures of the siroheme- and Fe4S4-containing active center of sulfite reductase in different states of oxidation, heme activation via reduction-gated exogenous ligand exchange [J].Biochemistry, 1997, 36(40): 12101-12119.

23 Rivasseau C, Seemann M, Boisson A M, et al.Accumulation of 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate in illuminated plant leaves at supraoptimal temperatures reveals a bottleneck of the prokaryotic methylerythritol 4-phosphate pathway of isoprenoid biosynthesis [J]. Plant, Cell & Environment,2009, 32(1): 82-92.

24 Veeranagouda Y, Benndorf D, Heipieper H J, et al.Purification and characterization of NAD-dependent n-butanol dehydrogenase from solvent-tolerant n-butanol-degrading Enterobacter sp VKGH12 [J].Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 18(4):663-669.

25 McCoolg J, Cannon M C. PhaC and PhaR are required for polyhydroxyalkanoic acid synthase activity in Bacillus megaterium [J]. Journal of Bacteriology, 2001, 183(14):4235-4243.

26 Zhang C, Wei J, Zheng Z, et al. Proteomic analysis of Deinococcus radiodurans recovering from gamma-irradiation [J]. Proteomics, 2005, 5(1): 138-143.

27 Lu H, Gaog, Xug, et al. Deinococcus radiodurans PprI switches on DNA damage-response and cellular survival networks after radiation damage [J]. Molecular and Cellular Proteomics, 2009, 8(3): 481-494.

28 Bigot A, Botton E, Dubail I. A homolog of Bacillus subtilis trigger factor in Listeria monocytogenes is involved in stress tolerance and bacterial virulence [J].Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(10):6623-6631.

29 Tanaka A, Hirano H, Kikuchi M, et al. Changes in cellular proteins of Deinococcus radiodurans following gamma irradiation [J]. Radiation and Environmental Biophysics,1996, 35(2): 95-99.

30 Joshi B, Schmid R, Altendorf K, et al. Protein recycling is a major component of post-irradiation recovery in Deinococcus radiodurans strain R1 [J]. Biochemical Biophysical Research Communications, 2004, 320(4):1112-1117.

31 Kish A, Kirkalig, Robinson C, et al. Salt shield:intracellular salts provide cellular protection against ionizing radiation in the halophilic archaeon,Halobacterium salinarum NRC-1 [J]. Environmental Microbiology, 2009, 11(5): 1066-1078.

32 Liu L, Li Y, Zhang J, et al. Complete genome sequence of the industrial strain Bacillus megaterium WSH-002 [J].Journal of Bacteriology, 2011, 193(22): 6389-6390.