林開顏 ，李沐 ，謝澤宇 ，楊劍玲 ，周文 ，黃欽國 ，許梓壁 ，王英博

高壓氧對外傷性癲癇動物模型的治療作用

林開顏1*，李沐2*，謝澤宇2，楊劍玲3，周文2，黃欽國2，許梓壁2，王英博2

目的：研究高壓氧治療（HBOT）對外傷性癲癇（PTE）動物模型的治療作用。方法：42只成年SD大鼠隨機(jī)分為正常組（12只）、模型組（12只）及HBOT組（18只），通過注射氯化亞鐵制作PTE模型，HBOT組予HBOT 3個(gè)療程，觀察各組癲癇發(fā)作的行為及腦電圖表現(xiàn)，RT-PCR檢測c-mycmRNA的表達(dá)。結(jié)果：HBOT組的癲癇發(fā)作較模型組明顯減少，腦電圖上癇樣放電潛伏期延長，頻率減慢和波幅降低；模型組中c-myc表達(dá)較正常組顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，HBOT組中c-myc表達(dá)顯著減少（P＜0.01）。結(jié)論：HBOT對PTE具有積極治療作用，其機(jī)制可能與ARF-MDM 2-p53通路及Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

外傷性癲癇；高壓氧；動物模型；c-myc

外傷性癲癇（post-traumatic epilepsy，PTE）是外傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）引起的一種癲癇形式，在TBI患者中PTE的發(fā)病率為1.9%～30%[1]。PTE主要是由于腦外傷后局部腦組織缺氧缺血，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，從而引起癲癇[2]。

高壓氧治療（hyperbaric oxygen therapy，HBOT）是指在高壓氧倉內(nèi)，吸入一個(gè)大氣壓（101.33 kPa）以上與環(huán)境同等壓力的純氧，通過血液循環(huán)攜帶更多的氧到病損的組織和器官，迅速改善和糾正組織缺氧，促進(jìn)病損組織的修復(fù)和功能恢復(fù)[3]。HBOT可在腦組織缺氧缺血的情況下，為組織細(xì)胞供氧，減少無氧酵解，維持能量代謝，阻斷鈣超載的過程，避免神經(jīng)細(xì)胞損傷的發(fā)生和發(fā)展；阻斷線粒體呼吸鏈發(fā)生“單價(jià)泄漏現(xiàn)象”，并保護(hù)線粒體免受自由基攻擊，減輕氧自由基對神經(jīng)細(xì)胞和腦微血管細(xì)胞的損害[4-7]。因此，本研究擬采用皮質(zhì)注射氯化亞鐵致PTE動物模型進(jìn)行HBOT治療，檢測HBOT后局部腦組織c-myc的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成年雄性SD大鼠42只，體質(zhì)量180～220 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組（n=12）、模型組（n=12）和 HBOT 組（n=18）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 正常組不予任何處理；模型組和HBOT組參考文獻(xiàn)[8]方法，大鼠以10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔麻醉，固定于立體定向架，暴露顱骨，根據(jù)注射部位確定鉆顱部位，右額葉運(yùn)動區(qū)皮質(zhì)注射FeCl2（0.1mol/L，10μL）致癇后立即腹腔內(nèi)注射3mg/kg生理鹽水。HBOT組致癇后予以HBOT，每次治療70min，艙內(nèi)氧濃度為80%～90%，氧分壓為0.170～0.180MPa；每天1次，每7次為1療程，療程間間歇3 d，共行21次治療，歷時(shí)30 d。

1.2.2 腦電記錄及行為學(xué)觀察 將前端鈍圓的純銀絲置于硬腦膜之外，用牙托粉將銀絲與顱骨牢固地固定起來，銀絲的另一端連接無線藍(lán)牙腦電監(jiān)測系統(tǒng)。3組在制模后以視頻腦電圖（video-EEG，VEEG） 進(jìn)行檢測。根據(jù)Racine分級，4級以上發(fā)作，EEG在尖、棘波基礎(chǔ)上出現(xiàn)陣發(fā)性異常放電為模型成功。

1.2.3 取材 制模后30 d將3組大鼠以100 g/L水合氯醛（0.3 g/kg）腹腔麻醉，經(jīng)左心室-升主動脈插管，室溫下灌注生理鹽水150m L，再灌注含4%多聚甲醛的0.1mol/L PBS（pH 值 7.4，4℃）300m L，完整取腦，取材（海馬及額葉），固定，石蠟包埋。約位于海馬CA3層面及額葉以石蠟切片機(jī)連續(xù)冠狀切片用于HE染色。

1.2.4 c-myc半定量PCR 用Trizol法提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，進(jìn)行PCR反應(yīng)。以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。引物用Primer prem ier5.0軟件設(shè)計(jì)。c-myc上游引物序列：5'-CAGCTCGCCCAAATCCTGTA-3'，下游引物序列：5'-TGATGGGGATGACCCTGACT-3'。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃1m in，變性 94 ℃ 20 s，退火 62 ℃ 30 s，延伸72℃30 s，最后一次延伸72℃5min，共27個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物鑒定：取PCR產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠上，IOOV電泳20min后觀察。圖像分析儀進(jìn)行圖像分析，計(jì)算待測基因光密度比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量結(jié)果以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）（x±s）表示，單因素方差分析兩兩比較LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)表現(xiàn)

FeC12注射致癇后 1～45min，大鼠出現(xiàn)陣發(fā)性凝視、不動，后開始表現(xiàn)為濕狗樣運(yùn)動，出現(xiàn)自動癥，如重復(fù)、刻板地點(diǎn)頭、咀嚼、哈欠、噴嚏等，伴面部抽動及輕度邊緣性驚厥，出現(xiàn)一側(cè)前肢震顫；站立、雙前肢震顫及持續(xù)性點(diǎn)頭；雙前肢震顫加重，失去平衡跌倒而出現(xiàn)全身性強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作；造模過程無死亡。麻醉清醒后，活動、進(jìn)食減少，局灶性發(fā)作多見，部分可見全身肌肉緊張、弓背。正常組無上述表現(xiàn)，模型組出現(xiàn)典型急性期、靜止期及發(fā)作期，HBOT組發(fā)作頻率及持續(xù)時(shí)間較模型組明顯減少。

2.2 腦電圖變化

正常組大鼠的EEG頻率以5～10 Hz為主，波幅＜200 pV，以低幅p波、Q波為主，散在e波，未見癲癇樣放電，見圖1A。模型組大鼠注射FeC12后平均經(jīng)過5 s的潛伏期，EEG表現(xiàn)出多種形式的癲癇樣放電波形，典型波形有單棘波、多棘波、多相棘波、棘節(jié)律、慢波、棘慢波、尖波、發(fā)作性節(jié)律波、發(fā)作后抑制等，頻率最快可達(dá)30 Hz，波幅高達(dá)310 pV以上，發(fā)作后可出現(xiàn)抑制波，部分存在亞臨床放電，見圖1B。與模型組比較，HBOT組癇樣放電潛伏期延長，頻率減慢和波幅降低，發(fā)作次數(shù)明顯減少，見圖1C。

2.3 組織學(xué)觀察

模型組及HBOT組的注射部位神經(jīng)元變性、死亡，細(xì)胞結(jié)構(gòu)瓦解、紊亂，見圖2。模型組海馬神經(jīng)元缺失，CA3區(qū)最明顯，細(xì)胞核固縮、濃染，出現(xiàn)嗜酸性神經(jīng)元，細(xì)胞排列紊亂，膠質(zhì)細(xì)胞增生，見圖3。與模型組比較，HBOT組神經(jīng)元變性、死亡，細(xì)胞結(jié)構(gòu)瓦解、紊亂較輕，見圖2C、3C。

2.4 高壓氧對c-mycmRNA表達(dá)的影響

正常組、模型組、HBOT組中c-myc mRNA 表達(dá)分別為（4.32±1.02）、（8.10±2.05）、（4.78±2.12），模型組中 c-myc 表達(dá)較正常組顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，HBOT組中 c-myc表達(dá)顯著減少（P＜0.01），見圖 4。

圖1 正常組（A）、模型組（B）、HBOT組（C）大鼠 EEG

3 討論

本研究制模大鼠的行為學(xué)及EEG表現(xiàn)均接近于臨床，且死亡率為0，認(rèn)為制模成功。

目前國內(nèi)外關(guān)于HBOT治療PTE的研究仍較少，且主要為臨床研究，治療機(jī)制的研究仍甚少。臨床研究認(rèn)為HBOT對PTE具有積極治療作用。苑來生等[9]通過對40例PTE患者進(jìn)行高壓氧綜合治療，并與非高壓氧治療的30例進(jìn)行療效比較，結(jié)果HBOT組的有效率為87.5%，對照組的有效率為66.7%，2組有效率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。目前國內(nèi)外尚無HBOT治療PTE動物模型研究，本研究將填補(bǔ)這方面的空白。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，HBOT組癲癇發(fā)作頻率及持續(xù)時(shí)間明顯減少；且HBOT組的EEG較模型組癇樣放電潛伏期延長，頻率減慢和波幅降低，發(fā)作次數(shù)明顯減少。鏡下觀察病理切片發(fā)現(xiàn)HBOT組神經(jīng)元變性、死亡的程度較模型組輕。這說明HBOT對PTE動物模型有積極治療作用。

細(xì)胞過度凋亡在PTE發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[10]。D'Ambrosio等[11]發(fā)現(xiàn)PTE大鼠在致傷第8周后出現(xiàn)自發(fā)性癲癇，病理切片發(fā)現(xiàn)損傷部位及附近區(qū)域腦組織神經(jīng)元丟失嚴(yán)重。本研究再次驗(yàn)證上述結(jié)果，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)HBOT可有效抑制神經(jīng)細(xì)胞過度凋亡。

圖2 正常組（A）、模型組（B）、HBOT 組（C）大鼠右側(cè)額葉組織學(xué)觀察（HE染色，×400）

圖3 正常組（A）、模型組（B）、HBOT組（C）大鼠右側(cè)海馬組織學(xué)觀察（HE染色，×400）

圖4 3組c-mycmRNA的PCR電泳圖

本研究發(fā)現(xiàn)模型組中c-myc表達(dá)較正常組顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，HBOT組中 c-myc表達(dá)顯著減少（P＜0.01）。筆者推測HBOT可能通過限制c-myc過度表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞過度凋亡，最終抑制PTE發(fā)作。有研究表明，MYC失調(diào)使ARF上調(diào)，并通過ARF-MDM 2-p53通路誘發(fā)凋亡[12,13]。與此同時(shí)，Efichen等和Ma-clean等證實(shí)MYC過度表達(dá)間接地抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)[14]；抑制凋亡蛋白（B cell lymphoma 2，Bcl-2）可調(diào)節(jié)線粒體外膜滲透率，以阻斷細(xì)胞色素 C（Cytochrome C）、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）等蛋白的釋放，從而抑制染色質(zhì)濃縮等致細(xì)胞凋亡的病理過程[15]。故筆者推測HBO治療PTE主要機(jī)制可能與ARF-MDM 2-p53通路及Bcl-2有關(guān)。

綜上所述，筆者認(rèn)為HBOT對PTE具有積極治療作用，其主要機(jī)制可能與ARF-MDM 2-p53通路及Bcl-2有關(guān)。本研究的樣本數(shù)量及觀察周期有其局限性，需進(jìn)一步深入研究。

[1]D'Ambrosio R,Perucca E.Epilepsy after head injury[J].Curr Opin Neurol,2004,17:731-735.

[2]Huh JW,Widing AG,RaghupathiR.M idline brain injury in the immature ratinducessustained cognitive deficits,bihem ispheric axonal injury and neurodegeneration[J].Exp Neurol,2008,213:84-92.

[3]Thom SR,Fisher D,Zhang J,etal.Stimulation of perivascularnitric oxide synthesisby oxygen[J].Am JPhysiol Heart Circ Physiol,2003,284:H1230-H1239.

[4]Rockswold SB,Rockswold GL,Vargo JM,et al.Effects of hyperbaric oxygenation therapy on cerebralmetabolism and intracranial pressure in severely brain injured patients[J].JNeurosurg,2001,94:403-411.

[5]Levasseur JE,AlessandriB,ReinertM,etal.Lactate,not glucose,up-regulatesMitochondrial oxygen consumption bothin sham and lateral fluid percussed rat brains[J].Neurosurgery,2006,59:1122-1131.

[6]Elayan IM,Axley MJ,Prasad PV,et al.Effect of hyperbaric oxygen treatmenton nitric oxide and oxygen free radicals in rat brain[J].J Neurophysiol,2000,83:2022-2029.

[7]Okamoto T,Hashimoto K,Aoki S,et al.Cerebral blood flow in patients with diffuse axonal injury-exam ination of the easy Z-score imaging system utility[J].Eur JNeurol,2007,14:540-547.

[8]林元相,徐如祥,姜曉丹,等.皮層注射氯化亞鐵建立外傷性癲癇動物模型[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2006,5:372-377.

[9]苑來生,劉德中,岳新燦,等.腦外傷性癲癇高壓氧綜合性治療臨床療效探討[J].中國臨床實(shí)用醫(yī)學(xué),2010,4:204-205.

[10]Prince DA,Parada I,Scalise K,et al.Epilepsy follow ing cortical injury:cellular and molecular mechanisms as targets for potential prophylaxis[J].Epilepsia,2009,50:30-40.

[11]D'Ambrosio R,Fairbanks JP,Fender JS,et al.Post-traumatic epilepsy following fluid percussion injury in the rat[J].Brain,2004,127:304-314.

[12]Meyer N,Penn LZ.Reflecting on 25 years with MYC[J].NatRev Cancer,2008,8:976-990.

[13]EilersM,Eisenman RN.Myc's broad reach[J].GenesDev,2008,22:2755-2766.

[14]張慶華,謝豐培,張眾.MYC的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2010,39:109-112.

[15]Harris M,Thompson C.The role of the Bcl-2 fam ily in the regulation of outermitochondrial membrane permeability [J].Cell Death Differ,2000,7:1182-1191.

Study of Therapeu tic E ffect of Hyperbaric Oxygen on Anim al M odels of Post-traum atic Ep ilepsy

LIN Kai-yan,LIMu,XIE Ze-yu,YANG Jian-ling,ZHOUWen，HUANG Qin-guo,XU Zi-bi,WANG Ying-bo.Department of Pediatrics,Shantou Central Hospital,Affiliated Shantou Hospital of Sun Yat-Sen University,Guangdong 515031,China

Objective:To investigate the therapeutic effect of Hyperbaric Oxygen therapy (HBOT)on posttraumatic epilepsy(PTE)rats.Methods:Forty-two adultSD ratswere random ly divide into controlgroup(n=12),modelgroup(n=12)and HBOT group(n=18).The traumatic epilepsymodelswere induced by injecting ferrous chloride.Then the HBOT group were treated by HBofor 3 courses.The behavior and electroencephalogram(EEG)of 3 groups were observed after traumatic epilepsy attack induction.And the expression level of c-myc mRNA was exam ined by Real-time PCR.Results:Compared with themodelgroup,the number of post-traumatic seizure attacks in HBOT group wasobviously decreased,and elongation of latentperiod of epileptiform discharge,frequency deceleration,amplitude decreasing were also observed in EEG.Compared with the control group,the expression levelsof c-myc in themodelgroup was significantly increased(P＜0.01).And compared with themodel group,the expression levelof c-myc in the HBOT group was significantly decreased(P＜0.01).Conclusion:HBOT has positive therapeutic effect for PTE,and themechanismsmay connectwith ARF-MDM 2-p53 pathway and expression of Bcl-2.

post-traumatic epilepsy;hyperbaric oxygen;animalmodel;c-myc

R741;R741.05

A

DOI10.3870/sjsscj.2014.05.007

1.汕頭市中心醫(yī)院（中山大學(xué)附屬汕頭醫(yī)院）兒科 廣東汕頭515031

2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 廣東汕頭515041

3.汕頭大學(xué)香港中文大學(xué)聯(lián)合汕頭國際眼科中心 廣東汕頭515041

廣東科技項(xiàng)目（No.2011B031800109）；國家級大學(xué)生自主創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（No.1056013092）

2013-12 -27

謝澤宇 shenjingwaike3@ 163.com

*為并列第一作者

（本文編輯：王晶）