魏微，徐琴，黃勇華

慢性低灌注大鼠基質金屬蛋白酶和淀粉樣物質的表達

魏微，徐琴，黃勇華

目的：研究慢性低灌注后基質金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9和淀粉樣物質Aβ40表達的變化。方法：Wistar大鼠48只隨機分為假手術組和缺血組各24只，缺血組大鼠結扎雙側頸總動脈，假手術組不造成缺血。免疫組化染色觀察MMP-2、MMP-9和Aβ40表達的變化。結果：缺血組大鼠低灌注后7 d，免疫組化染色顯示MMP-2和Aβ40在皮質的靜脈內皮上有陽性表達；低灌注后14 d，MMP-2和Aβ40在較小動脈內皮上陽性表達；低灌注后30 d在相對較大的動脈內皮上陽性表達；MMP-9在血管內皮未見表達。結論：慢性低灌注后Aβ40在血管內皮沉積，MMP-2表達增加。

慢性低灌注；基質金屬蛋白酶；淀粉樣物質

huangyh@163.com

已有研究報道大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后淀粉樣物質（amyloid）空間及時間分布的特點[1]，但是對慢性低灌注狀態(tài)下淀粉樣物質的沉積狀況的研究少見報道。基質金屬蛋白酶 -2（matrixmetalloproteinases-2，MMP-2）和MMP-9可降解細胞外基質，參與缺血后的血腦屏障破壞及神經修復，二者可能與淀粉樣物質的排出有關，但既往對于二者的關系結論研究結果并不一致[2-5]。本研究通過雙側頸總動脈結扎制備慢性低灌注模型，來觀察淀粉樣物質Aβ40及MMP-2,9的沉積特點，探討淀粉樣物質異常沉積的機制，期望對阿爾茨海默病（A lzheimer's disease，AD）及腦淀粉樣血管病（cerebralamyloid angiopathy,CAA）的防治工作有益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性SPF級Wistar大鼠36只，體質量為260～300 g，由軍事醫(yī)學科學院提供。

1.1.2 主要試劑 兔源Aβ40、MMP-2和MMP-9的一抗購自英國Abcam公司；生物素標記的山羊抗兔二抗和鏈霉卵白素標記的辣根酶三抗均購自中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及干預 36只大鼠隨機分為假手術組、缺血組各18只，每組大鼠均按時間點分為缺血后 7 d、14 d、30 d三個亞組。10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定，沿頸正中切口切開皮膚后小心剝離肌肉，暴露頸總、頸內、頸外動脈，并分離迷走神經（避免牽拉）。缺血組大鼠結扎雙側頸總動脈，假手術組不結扎。在同條件的層流動物室飼養(yǎng)（大鼠總死亡率8.3%，共死亡大鼠3只，按需補足）。

1.2.2 病理學檢測 ①灌流取腦：各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（350mg/kg）麻醉，打開胸腔，充分暴露心臟，從心尖部位插入灌注針頭直至主動脈，剪開右心耳。灌注生理鹽水約150m L至流出液清亮，繼續(xù)用4%多聚甲醛溶液灌注250m L至大鼠全身僵硬為止。從頸椎處剪斷頸髓，分離顱底組織，完整取出大腦置入4%多聚甲醛溶液中后固定備用。②石蠟包埋與切片：經固定的腦組織，取前囟后3.6～4.8mm處腦組織，腦組織經10%～100%酒精，逐步脫凈水分，用25%、50%、70%、90%二甲苯-無水乙醇透化，浸蠟，包埋，于旋轉切片機上切成5μm厚的連續(xù)蠟帶。③免疫組化染色：石蠟切片脫蠟水化，0.01mol/L PBS浸洗5m in×3次，3%甲醇雙氧水室溫孵育15m in，阻斷內源性過氧化物酶的活性，蒸餾水浸洗3m in×2次，PBS浸洗5m in×3次，加入0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液微波修復5min×2次，自然冷卻后PBS浸洗3min×3次，滴加非免疫性山羊血清，室溫孵育30min后棄去多余血清，滴加一抗：兔抗 MMP-2（1 ∶75）、MMP-9（1∶100）、Aβ40（1∶75）4 ℃冰箱過夜，陰性對照以PBS替代一抗，室溫下放置30m in后PBS浸洗5min×3次，滴加生物素標記羊抗兔二抗工作液，37℃孵育30min，PBS 浸洗 5m in×3 次，滴加 SABC液，37 ℃孵育 30m in，PBS 浸洗 5m in×4次，滴加DAB顯色5～7m in，顯微鏡觀察滿意后立即以自來水充分沖洗終止反應，蘇木素輕微復染，1%鹽酸分化，1%氨水反藍，70%～100%梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2 結果

缺血組大鼠低灌注后7 d，免疫組化染色顯示MMP-2和Aβ40在皮質的靜脈內皮上有陽性表達；低灌注后14 d，MMP-2和Aβ40在較小動脈內皮上陽性表達；低灌注后30 d在相對較大的動脈內皮上陽性表達（圖1）；MMP-9在血管內皮未見表達。

3 討論

圖1 2組大鼠MMP-2和Aβ40在腦組織的表達

腦慢性低灌注與血腦屏障的破壞及腦白質疏松常伴隨發(fā)生[6,7]。腦慢性缺血導致血腦屏障損傷，引起血清成分滲漏，神經元和膠質細胞損傷。大量的臨床研究證實AD患者病程早期即有腦部低灌注現象，繼之出現AD的臨床特征，提示慢性低灌注腦缺血是引起AD的重要因素[8]。本研究證實腦慢性低灌注可造成Aβ40的異常沉積。在腦低灌注7 d后Aβ40在小血管內皮細胞沉積，低灌注14 d后沉積在大血管壁上，1月后Aβ40的沉積更加明顯。隨著缺血時間延長，Aβ40異常沉積的血管直徑逐漸增大。Weller等[9]的研究認為AD/CAA的主要病理特征即Aβ異常聚集并且沉積在腦實質及腦血管壁上。Aβ主要分布在毛細血管及與血管周圍引流通路相關的動脈基膜上，血管周圍引流通路是將淀粉樣物質從腦中清除的有效引流途徑[9]。血管搏動是組織間液和溶質經血管周圍引流的動力，因此Aβ的代謝物靠血管搏動的動力沿血管周圍引流的途徑排出。這種沉積的變化規(guī)律與淀粉樣物質代謝途徑學說相符合。因此，筆者推測雙側頸總動脈結扎后，遠端的動脈搏動減弱，導致Aβ的排泄途徑受阻，從而加速Aβ在腦內的異常沉積。Aβ增加內皮素的縮血管作用，影響血流動力學，引起腦的低灌注。低灌注后繼發(fā)慢性缺血缺氧，又可以使血腦屏障受到破壞，形成惡性循環(huán)。Aβ40沉積于引流通路上發(fā)生CAA，并阻斷可溶性Aβ的引流。血管周圍Aβ的引流被阻斷及在動脈壁上的異常沉積引起以下疾?。孩貱AA：Aβ異常沉積引起動脈破壞，引起腦出血；②AD：腦中清除Aβ及其他可溶性代謝產物受阻，神經元微環(huán)境穩(wěn)態(tài)被打亂后引起認知障礙，嚴重時發(fā)生癡呆[10-12]。此外，慢性低灌注也可引起神經元凋亡，二者的共同作用致使神經元大量脫失，發(fā)生認知障礙。本研究結果支持腦慢性低灌注影響Aβ代謝，引流障礙是造成Aβ40異常沉積的主要因素，而Aβ40在血管內皮細胞的異常沉積造成血腦屏障的進一步損害，加重腦缺血[13,14]。有研究發(fā)現淀粉樣物質在毛細血管基底膜沉積，且以板狀的形式突入神經氈內[15,16]。其中，Aβ40主要沉積在動脈壁[17,18]，Aβ42 則沉積在老年斑[19,20]。今后可進一步觀察慢性低灌注是否影響Aβ42沉積在老年斑，慢性低灌注對腦內Aβ代謝的影響。本研究更好地模擬了在體內環(huán)境下低灌注促進Aβ40沉積的動態(tài)變化，為制備CAA的動物模型進行了有益的探索。

MMP是一族鋅離子依賴性內肽酶，是Ⅳ型膠原酶是最重要的一類。研究表明，MMP-2參與機體的眾多病理生理過程調節(jié)，如組織重塑、傷口修復、細胞凋亡、炎癥和腫瘤等。MMP-9除參與人體的正常發(fā)育過程外，還在慢性阻塞性肺疾病、心血管疾病、神經系統(tǒng)疾病、腫瘤的病理過程中發(fā)揮重要作用[20,21]。既往的研究發(fā)現缺血后MMP-9能降解Aβ。毛玲等[22]研究發(fā)現低灌注模型組海馬區(qū)血管周圍有辣根過氧化物酶反應產物和MMP-9的表達，隨著全腦低灌注時間的延長，表達量增加。本研究則表明，低灌注后7 d在皮質的靜脈內皮上有MMP-2和Aβ40陽性表達；低灌注后14 d在較小動脈內皮上有MMP-2和Aβ40陽性表達；低灌注后30 d在相對較大的動脈內皮上有MMP-2和Aβ40陽性表達。未見MMP-9在血管內皮的表達。

筆者推測MMP-2在慢性低灌注后降解細胞外基質破壞血腦屏障，并影響Aβ的前體蛋白（β-amyloid precursor protein，β-APP）的代謝，從而間接影響Aβ40的異常沉積，是AD/CAA發(fā)病的一個中間的重要環(huán)節(jié)。本研究未發(fā)現MMP-9的明顯變化，與既往研究結果不一致，是否與慢性低灌注后觀察時間點不一致及取材部位等有關，尚待進一步研究。

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Exp ression of M atrix M etallop roteinases-2,9 andβ-am y loid in Rats after Ch ronic Brain

Hypoperfusion

WEIWei,XU Qin,HUANG Yong-hua.Department of Neurology,Beijing M ilitary General Hospital,Beijing 100700,China

Objective:To study the expression of Matrix metalloproteinases(MMP-2,MMP-9)andβ-amyloid(Aβ40)in the brain of ratswith chronic hypoperfusion.Methods:Fourty-eightWistar ratswere random ly divided into sham group and ischemic group(24 rats in each group).For the rats in the ischemic group,the bilateral common carotid arterieswere ligated.The rats in the sham group

similar operation withoutocclusion in the the bilateralcommon carotid arteries.Immunohistochemicalstainingwas performed to investigate the expression of MMP-2,MMP-9 and Aβ40.Results:In the ischemic group,the expression of MMP-2 and Aβ40 was observed in vein endothelium at7 days after chronic hypoperfusion,in small artery endothelium at14 days after chronic hypoperfusion,and in large artery endothelium at30 days after chronic hypoperfusion.The expression of MMP-9 in ischemic group was notobserved in blood vessel endothelium.Conclusion:Chronic brain hypoperfusion in rats can result in the deposition of Aβ,and thealteration of theexpression ofMMP-2.

chronic hypoperfusion;matrixmetalloproteinases;β-amyloid

R741;R741.02

A

DOI10.3870/sjsscj.2014.05.004

北京軍區(qū)總醫(yī)院神經內科 北京100700

國家自然科學基金（No.81171100）

2014-02 -28

黃勇華

（本文編輯：王晶）