鐘君偉，朱永安，付佩勝,安麗，呂寶玉（山東省淡水漁業(yè)研究院，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種 重點實驗室，山東 濟南 250013）

在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中，尤其是高密度養(yǎng)殖模式下，人工向水體投入大量的配合飼料，水體中有機代謝廢物大量沉積，特別是亞硝酸鹽濃度逐漸升高，往往引起水產(chǎn)動物的的生理異常甚至死亡，其產(chǎn)生的毒性作用直接影響動物的存活、生長和發(fā)育，成為誘發(fā)病害的主要因子。國內(nèi)外許多學(xué)者研究了亞硝酸鹽對水產(chǎn)動物的急性毒性效應(yīng)，進(jìn)行了病理學(xué)研究并探討了其中毒機理[1－5]。

克氏原螯蝦 （Procambarus clarkii）俗稱淡水小龍蝦，分類學(xué)上屬節(jié)肢動物門甲殼綱軟甲亞綱十足目螯蝦亞目蜊蛄科原螯蝦屬，原產(chǎn)北美洲，20世紀(jì)30年代末由日本傳入我國。由于其因肉味鮮美，適應(yīng)性廣、繁殖力強，能適應(yīng)稻田、池塘、灘地等多種水域養(yǎng)殖，已成為我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟蝦類，是目前我國水產(chǎn)業(yè)中發(fā)展最為迅速、最具特色、最有潛力的養(yǎng)殖品種之一。目前對克氏原螯蝦的研究主要集中在繁殖生物學(xué)、營養(yǎng)生理、基礎(chǔ)代謝、重金屬污染等方面[6－11]，而有關(guān)環(huán)境因子亞硝酸鹽氮對克氏原螯蝦影響，僅見于對幼蝦、仔蝦的急性毒性效應(yīng)研究[12－13]，未見對其成蝦的毒性效應(yīng)報道及其亞硝酸鹽脅迫對相關(guān)免疫指標(biāo)的影響。本研究不僅探討了亞硝酸鹽對克氏原螯蝦成蝦的急性毒性效應(yīng)，而且進(jìn)一步測定其在安全濃度狀態(tài)下克氏原螯蝦肝胰腺超氧化物歧化酶 （T-SOD）、過氧化氫酶 （CAT）、酸性磷酸酶 （ACP）和堿性磷酸酶 （AKP）活性在72h內(nèi)的變化情況，以進(jìn)一步探明克氏原螯蝦受到亞硝酸鹽作用后相關(guān)免疫因子的變化情況，為克氏原螯蝦的健康養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用克氏原螫蝦體重為 （9.32±1.57）g，體長為 （6.91±0.41）cm，取自山東省東平縣第一淡水養(yǎng)殖試驗場，在室內(nèi)暫養(yǎng)7d。暫養(yǎng)和試驗容器均為裝有20L水的塑料水族箱 （57cm×40cm×34cm），試驗前24h停食，并從中選擇體質(zhì)健壯、體色一致、活動性強和附肢完整的成蝦作為試驗用蝦。

試驗在山東省淡水漁業(yè)研究院國家級水產(chǎn)良種場溫室中進(jìn)行，試驗水源為玉景礦泉水廠700m深井水，其水質(zhì)指標(biāo)如下：水溫 （20.9±2.9）℃，pH 7.86，DO （5.24±0.63）mg／L，溶解性總固體（TDS）（0.44±0.05）mg／L；0.03mg／L；未檢出。試驗期間采用24h連續(xù)充氣增氧，試驗期間不控溫不投喂。

1.2 試驗方法

（1）亞硝酸鹽對克氏原螯蝦的急性毒性試驗 經(jīng)預(yù)備試驗，確定各組藥物質(zhì)量濃度范圍 （96h全活質(zhì)量濃度上限和24h全部致死質(zhì)量濃度下限）后，在室溫條件下，采用半靜水停食實驗法，按等對數(shù)間距設(shè)置7個質(zhì)量濃度梯度組 （16.00、24.11、36.32、54.72、82.44、124.20mg／L和187.12mg／L）和1個清水對照組，每組3個平行，為保證試驗期間藥物濃度的穩(wěn)定，每24h全部換液1次。

試驗開始的前10h連續(xù)觀察，及時取出死亡成蝦并排污，記錄24、48、72、96h各組蝦的癥狀及死亡數(shù)。其死亡的個體以鑷子碰觸蝦體腹部完全無反應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)試驗結(jié)果，參照譚蘋[14]的方法，按改良寇氏法求出各藥物的半數(shù)致死質(zhì)量濃度 （LC50），再求得安全濃度 （SC）。

安全濃度 （SC）＝48hLC50×0.3／ （24hLC50／48hLC50）2

式中，24hLC50、48hLC50分別為24、48h的半致死質(zhì)量濃度。

（2）亞硝酸鹽對克氏原螯蝦抗病因子影響試驗 脅迫濃度在安全濃度 （12.32mg／L）基礎(chǔ)上設(shè)置為12mg／L亞硝酸鹽氮濃度組和0mg／L對照組。準(zhǔn)確稱取亞硝酸鈉放入裝有20L水的塑料水族箱 （57cm×40cm×34cm）溶解完全后，每試驗組隨機放入活性旺盛的克氏原螯蝦20只，每平行重復(fù)2組。持續(xù)充氣，每24h更換試驗溶液1次以維持藥物濃度。

于脅迫后12、24、48、60h和72h分別從試驗組和對照組隨機取出3只蝦，在冰上迅速采集肝胰腺組織樣品，分別加9倍質(zhì)量0.85%預(yù)冷無菌生理鹽水制備成10%的組織勻漿，在冰浴條件下進(jìn)行勻漿。勻漿液經(jīng)3000r／min4℃離心15min，吸取上清液于潔凈的離心管中－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用南京建成生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒分別測定肝胰腺的氧化物歧化酶 （T-SOD）、過氧化氫酶 （CAT）、酸性磷酸酶 （ACP）和堿性磷酸酶 （AKP）活性，測定方法按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。每個樣品重復(fù)2次。T-SOD定義為每毫克組織蛋白在1ml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為1個SOD活性單位 （U／mgProt）；組織中CAT以1mg蛋白1s分解1μmol的H2O2的量為1個活性單位 （U／mgProt）；ACP定義為每克組織蛋白在37℃與基質(zhì)作用15min產(chǎn)生1mg酚為1個活性單位（U／gProt）；AKP定義為每克組織蛋白在37℃與基質(zhì)作用15min產(chǎn)生1mg酚為1個活性單位（U／gProt）；采用考馬斯亮藍(lán)顯色法測定總蛋白含量，單位為g／L。

脅迫影響的相關(guān)試驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件處理，并采用雙尾t檢驗法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，以P≤0.05作為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸鹽對克氏原螯蝦的毒性

試驗初期，試驗組克氏原螯蝦活動狀況與對照組基本相似，都散落在箱體底部緩慢爬動，碰觸后反應(yīng)敏捷。隨著接觸時間的延長，克氏原螯蝦在不同試驗組中出現(xiàn)不同程度的游動加劇、上下串游、游動遲緩等不安狀況。試驗開始5h后，124.20mg／L和187.12mg／L濃度組出現(xiàn)中毒癥狀，部分成蝦急躁不安，沿箱壁快速游動。7h后行動減緩，不時側(cè)游、側(cè)翻，游泳足擺動緩慢，若受觸動，能迅速逃游，但片刻后又側(cè)翻、側(cè)游，有部分蝦腹部朝上彎曲，反應(yīng)遲鈍。10h后187.12mg／L組平均已有4尾身體彎曲，體色變暗，活動微弱，若受驚，已不能逃游，呈昏迷狀態(tài)，沉入水底不動。24h后死亡成蝦體色變暗，頭胸部與腹部有明顯的分節(jié)。

表1為亞硝酸鹽氮對克氏原螯蝦成蝦的急性毒性試驗結(jié)果。在一定試驗時間內(nèi)，隨著的濃度越高，克氏原螯蝦的死亡率越高；而在相同的染毒時間內(nèi)，濃度越高，克氏原螯蝦的死亡率越高。依據(jù)表1的數(shù)據(jù)，根據(jù)改良寇氏法計算對克氏原螯蝦的24、48、72h和96hLC50（95%可信 區(qū) 間 ） 分 別 為 118.00mg／L （94.21～147.78mg／L）、83.00mg／L （65.87～104.59mg／L）、41.07mg／L （32.97～51.16mg／L）和 35.70mg／L （29.03～43.92mg／L），安全質(zhì) 量 濃 度 （SC）為12.32mg／L。

表1 亞硝酸鹽氮對克氏原螯蝦成蝦的急性毒性試驗結(jié)果

2.2 亞硝酸鹽氮對克氏原螯蝦肝胰腺T-SOD和CAT活性的影響

水體中亞硝酸鹽氮在安全濃度內(nèi)對克氏原螯蝦成蝦肝胰腺抗氧化酶類活性影響如圖1所示。對照組肝胰腺T-SOD活性在60h內(nèi)相對穩(wěn)定，呈小幅波動，差異不顯著 （P＞0.05），隨著饑餓時間的延長，在72h時顯著降低至（15.24±2.99）U／mgProt；在12mg／L脅迫24h后，肝胰腺T-SOD活性迅速降低 （P＜0.05），此后T-SOD活性均明顯低于對照組 （P＜0.05），除48h外，抑制程度逐漸增加，在72h時抑制程度最高為37.77%。說明12mg／L對肝胰腺T-SOD活性影響主要表現(xiàn)為抑制作用，且隨著時間延長抑制程度加深。

對照組肝胰腺CAT活性在72h內(nèi)相對穩(wěn)定，呈小幅波動，差異不顯著 （P＞0.05）；在12mg／L脅迫12h后，肝胰腺T-SOD活性迅速降低（P＜0.05），在24h時抑制程度最高為55.18%。雖在60h后CAT活性有所上升，但明顯低于對照組（P＜0.05）。說明在12mg／L對肝胰腺CAT活性影響主要表現(xiàn)為抑制作用，且抑制時間要早于T-SOD。

圖1 亞硝酸鹽氮脅迫對克氏原螯蝦抗氧化酶類活性的影響

2.3 亞硝酸鹽氮對克氏原螯蝦肝胰腺酸、堿磷酸酶活性的影響

水體中亞硝酸鹽氮在安全濃度內(nèi)對克氏原螯蝦成蝦肝胰腺酸、堿磷酸酶活性的影響如圖2所示。圖2顯示：整個試驗過程中，在12mg／L脅迫下，克氏原螯蝦肝胰腺ACP和AKP活性表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律，即在12h時均顯著高于對照組 （P＜0.05），其中 ACP達(dá)到 （255.65±36.22）U／gProt，AKP升高至 （14.50±1.96）U／gProt；隨著時間延長，試驗組ACP和AKP活性迅速降低至對照組水平，且差異不顯著 （P＞0.05）。說明克氏原螯蝦肝胰腺ACP和AKP能在較短時間內(nèi)對12mg／L脅迫產(chǎn)生響應(yīng)，并能快速適應(yīng)脅迫環(huán)境。

圖2 亞硝酸鹽氮脅迫對克氏原螯蝦酸、堿磷酸酶活性的影響

3 討論

亞硝酸鹽是養(yǎng)殖水體中重要的污染物，是導(dǎo)致甲殼動物免疫能力降低、疾病發(fā)生的重要因素，可引起機體生理生化因子及組織結(jié)構(gòu)的改變，并能改變與免疫抗病能力有關(guān)酶類的活性。在試驗過程中，中毒克氏原螯蝦先表現(xiàn)為游動加劇，后動作遲緩；死亡個體體色變暗，頭胸部與腹部有明顯的分節(jié)。其安全質(zhì)量濃度 （SC）為12.32mg／L，是幼蝦[12]（SC 為6.97mg／L）及仔蝦[13]（SC 為1.52mg／L）的1.77倍和8.11倍，這說明克氏原螯蝦對的耐受力隨個體發(fā)育而逐漸增強。

亞硝酸鹽中毒組織病變最嚴(yán)重的器官是肝胰腺[15]，且會對甲殼動物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用，使其免疫功能下降。王玥等[16]以1mg／L的亞硝態(tài)氮作用于羅氏沼蝦10d后，使其血清、肝胰腺和肌肉組織中的PO、SOD、ACP及AKP的活性顯著降低，降低了該蝦的免疫功能。本試驗結(jié)果表明，12mg／L對肝胰腺T-SOD及CAT活性影響主要表現(xiàn)為抑制作用，且CAT活性且抑制時間要早于T-SOD，T-SOD活性隨著時間延長抑制程度加深。說明即使處于安全濃度內(nèi)，12mg／L仍會抑制肝胰腺T-SOD及CAT活性，導(dǎo)致清除體內(nèi)氧自由基能力降低，對克氏原螯蝦產(chǎn)生一定毒性。

在甲殼動物的免疫體系中，ACP和AKP均為磷酸單酯酶，主要分布在肝胰腺、血淋巴中，是甲殼動物溶酶體酶的重要組成成分，在免疫應(yīng)答中起重要的作用。肝胰腺作為重要的解毒器官和脂肪代謝場所，其中具有水解酶作用的ACP含量較為豐富，因而ACP活力必然高得多，這點在本研究中也得到進(jìn)一步驗證。本研究中肝胰腺ACP和AKP除在12h時活性顯著增強外，其他時間下與對照組差異并不明顯，因此克氏原螯蝦肝胰腺ACP和AKP能在短時間內(nèi)對12mg／L應(yīng)激產(chǎn)生響應(yīng)，并能盡快適應(yīng)。這點與對紅螯光殼螯蝦幼蝦肝胰腺ACP和AKP的抑制影響不同[5]，這可能與受試物種、蝦體規(guī)格或試驗條件有關(guān)。

《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽不高于0.2mg／L，而對克氏原螯蝦成蝦的安全濃度分別為12.32mg／L，是水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的，61.6倍，說明克氏原螯蝦成蝦能搞耐受較高濃度的；但即使處于安全濃度內(nèi)，雖然不會導(dǎo)致成蝦死亡，12mg／L依然能夠抑制抑制肝胰腺T-SOD及CAT活性。

[1]呂曉燕 .亞硝酸鹽和氨氮對紅螯光殼螯蝦生理生化的影響 [D].上海：華東師范大學(xué)，2011.

[2]曲克明，徐 勇，馬紹賽，等.不同溶解氧條件下亞硝酸鹽和非離子氨對大菱鲆的急性毒性效應(yīng) [J].海洋水產(chǎn)研究，2007，28（4）：83-88.

[3]Chen J，Chin T.Acute toxicity of nitrite to tiger prawn，Penaeus monodon，larvae[J].Aquaculture，1988，69：253-262.

[4]王 娟，曲克明，劉海英，等.不同溶氧條件下亞硝酸鹽和氨氮對中國對蝦的急性毒性效應(yīng) [J].海洋水產(chǎn)研究，2007，28（6）：1-6.

[5]呂曉燕，李嘉堯，方 燕，等.亞硝酸鹽對紅螯光殼螯蝦不同組織免疫相關(guān)酶活性及超微結(jié)構(gòu)的影響 [J].水產(chǎn)學(xué)報，2010，（12）：1812-1820.

[6]李 銘，董衛(wèi)軍，徐加元，等.維生素E對克氏原螯蝦生殖的影響 [J].水產(chǎn)學(xué)報，2007，31（Z1）：65-68.

[7]慕 峰，吳旭干，成永旭，等.克氏原螯蝦胚胎發(fā)育的形態(tài)學(xué)變化 [J].水產(chǎn)學(xué)報，2007，31（B09）：6-11.

[8]吳 東，夏倫志，侯冠軍，等.3種蛋白水平飼料對克氏螯蝦生長和蝦肉品質(zhì)的影響 [J].淡水漁業(yè)，2007，37（5）：36-40.

[9]譚樹華，何 艷，謝 佳，等.高濃度Zn2＋對克氏原螯蝦幾種免疫學(xué)相關(guān)指標(biāo)的影響 [J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報.2007，23（4）：67-71.

[10]趙 婷.克氏原螯蝦 （Procambarus clarkii）對銅脅迫的免疫響應(yīng)研究 [D].太原：山西大學(xué)，2011.

[11]譚樹華，鄧先余，蔣文明，等.高濃度鉻對克氏原螯蝦抗氧化酶系統(tǒng)的影響 [J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2007，26（4）：1356-1360.

[12]於葉兵，陸 偉，黃金田，等.亞硝酸鹽和硫化物對克氏原螯蝦幼蝦的毒性效應(yīng)研究 [J].水生態(tài)學(xué)雜志，2011，32（1）：111-114.

[13]羅靜波，曹志華，溫小波，等.亞硝酸鹽氮對克氏原螯蝦仔蝦的急性毒性效應(yīng) [J].長江大學(xué)學(xué)報 （自然科學(xué)版），2005，2（11）：64-66.

[14]譚 蘋.應(yīng)用Excel軟件計算半數(shù)致死量 [J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010（10）：914-916.

[15]吳中華，劉昌彬.中國對蝦慢性亞硝酸鹽和氨中毒的組織病理學(xué)研究 [J].華中師范大學(xué)學(xué)報 （自然科學(xué)版），1999，33（1）：119-122.

[16]王 玥，胡義波，姜乃澄.氨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮對羅氏沼蝦免疫相關(guān)酶類的影響 [J].浙江大學(xué)學(xué)報 （理學(xué)版），2005，32（6）：698-705.