王東平，閆小鈞

(吉林省藥品檢驗(yàn)所，吉林 長(zhǎng)春 130033)

HPLC同時(shí)測(cè)定痛風(fēng)定片中馬錢苷酸與龍膽苦苷的含量

王東平*，閆小鈞

(吉林省藥品檢驗(yàn)所，吉林 長(zhǎng)春 130033)

目的：建立痛風(fēng)定片中馬錢苷酸、龍膽苦苷的含量測(cè)定方法。方法：采用Apollo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液(1∶4)，流速為0.7 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。結(jié)果：馬錢苷酸的進(jìn)樣量在0.095～0.855 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.998 7)，平均回收率為98.73%，RSD=2.01%(n=6)；龍膽苦苷的進(jìn)樣量在0.418～2.092 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)，平均回收率為98.36%，RSD=0.90%(n=6)。結(jié)論：該法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、分離度與穩(wěn)定性好、專屬性強(qiáng)，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

痛風(fēng)定片；HPLC；馬錢苷酸；龍膽苦苷；含量測(cè)定

痛風(fēng)定片是由秦艽、黃柏、延胡索、赤芍等8味中藥組成，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ12302005-2010(Z)。秦艽為痛風(fēng)定片中君藥，在方中所占比例為17.5%。秦艽為龍膽科植物秦艽GentianamacrophyllaPall.、麻花秦艽GentianastramineaMaxim.、粗莖秦艽GentianacrassicaulisDuthie ex Burk.或小秦艽GentianadahuricaFisch.的干燥根[1]，主要含馬錢苷酸、龍膽苦苷等[2-5]。痛風(fēng)定片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)黃柏含量測(cè)定進(jìn)行了規(guī)定，為了更好控制藥品質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜法同時(shí)對(duì)方中馬錢苷酸、龍膽苦苷含量進(jìn)行測(cè)定，并以二者為指標(biāo)來(lái)控制痛風(fēng)定片的質(zhì)量[2]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀(日本島津)；DAD二極管陣列檢測(cè)器(日本島津)。

1.2 試藥

馬錢苷酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111865-201102，含量：93.8%)；龍膽苦苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110770-200308)；痛風(fēng)定片(長(zhǎng)春海外制藥集團(tuán)有限公司，規(guī)格：0.4 g/片，批號(hào)：20110801，20110802，20110803，20110804，20110805，20111202，20111203，20111204)；甲醇、磷酸為色譜純，水為超純水，其他試劑為化學(xué)純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Apollo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液(1∶4)；流速為0.7 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；分離度大于1.5；理論板數(shù)按馬錢苷酸峰和龍膽苦苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。HPLC圖見(jiàn)圖1。

A.混合對(duì)照品 B.供試品 C.缺秦艽的陰性對(duì)照品1.馬錢苷酸 2.龍膽苦苷?qǐng)D1 痛風(fēng)定片及對(duì)照品HPLC圖

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

取馬錢苷酸和龍膽苦苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含馬錢苷酸0.10 mg、含龍膽苦苷0.25 mg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備[2-3]

取重量差異項(xiàng)下的痛風(fēng)定片，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率180 W，頻率60 kHz)45 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照品溶液的制備

按處方量制備不含秦艽的陰性對(duì)照樣品，按2.3方法制備缺秦艽的陰性對(duì)照品溶液，即得。

2.5 線性關(guān)系考察

精密稱取馬錢苷酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含馬錢苷酸0.095 0 mg的溶液，即得。精密稱取龍膽苦苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含龍膽苦苷0.418 4 mg的溶液，即得。分別精密吸取馬錢苷酸對(duì)照品溶液1，3，5，7，9 μL，龍膽苦苷對(duì)照品溶液1，2，3，4，5 μL，進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果馬錢苷酸在0.095 0～0.855 μg、龍膽苦苷在0.418 4～2.092 μg線性關(guān)系良好，符合外標(biāo)法定量測(cè)定的要求。

馬錢苷酸回歸方程：Y=756 197.894 74X+14 680.7(r=0.998 7)，龍膽苦苷回歸方程：Y=1 421 538.957 93X-44 659.3(r=0.999 9)。

2.6 精密度試驗(yàn)

取同一份供試品溶液(批號(hào)：20110805)，按2.1色譜條件，精密吸取供試品溶液5 μL，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算馬錢苷酸峰面積的RSD=2.51%，龍膽苦苷峰面積的RSD=0.86%。結(jié)果表明，所用儀器精密性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液(批號(hào)：20110805)，分別在0，4，8，12，16，18，24，28，32 h，按2.1色譜條件測(cè)定，計(jì)算馬錢苷酸峰面積的RSD=0.94%；龍膽苦苷峰面積的RSD=0.49%。結(jié)果表明，供試品溶液在32 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(批號(hào)：20110805)6份，按2.3方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果馬錢苷酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.855 mg·g-1，RSD=1.26%；龍膽苦苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.174 mg·g-1，RSD=0.73%。結(jié)果表明，本法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

精密稱取馬錢苷酸和龍膽苦苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含馬錢苷酸0.044 5 mg、含龍膽苦苷0.114 6 mg的混合對(duì)照品溶液，作為加標(biāo)對(duì)照品溶液。精密稱取同法測(cè)定已知含量的供試品(批號(hào)：20110805)6份，每份約0.5 g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入加標(biāo)對(duì)照品溶液25 mL，按2.3方法制備供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1 痛風(fēng)定片中馬錢苷酸回收率試驗(yàn)

注：馬錢苷酸對(duì)照品加入量均為1.042 6 mg

表2 痛風(fēng)定片中龍膽苦苷回收率試驗(yàn)

注：龍膽苦苷對(duì)照品加入量均為2.865 mg

2.10 痛風(fēng)定片樣品測(cè)定

依上述方法測(cè)定8批痛風(fēng)定片樣品中馬錢苷酸和龍膽苦苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 痛風(fēng)定片中馬錢苷酸、龍膽苦苷的測(cè)定 mg/片

3 討論

3.1 色譜柱的選擇及柱效的考察

比較了Apollo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)兩種色譜柱，按照《中國(guó)藥典》2010版秦艽項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果二者均能較好地將馬錢苷酸、龍膽苦苷分離，保留時(shí)間均在15～30 min，最終選用Apollo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，按照上述方法測(cè)定，得到馬錢苷酸、龍膽苦苷對(duì)照品以及供試品的色譜圖，測(cè)得理論板數(shù)按馬錢苷酸峰計(jì)算為10 826。在此條件下，供試品可以得到很好的分離，且主峰前后無(wú)雜峰，考慮到實(shí)際情況，確定其理論板數(shù)應(yīng)不低于3 000。

3.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)馬錢苷酸及龍膽苦苷對(duì)照品的光譜掃描圖，馬錢苷酸在235 nm有最大吸收，龍膽苦苷在246 nm有最大吸收。參照《中國(guó)藥典》2010版一部秦艽項(xiàng)下含量測(cè)定的方法，確定254 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇

參照《中國(guó)藥典》2010版的方法，采用甲醇-0.1%磷酸溶液(1∶4)系統(tǒng)為本法流動(dòng)相，通過(guò)試驗(yàn)，將二者比例調(diào)至20∶80，在此條件下，供試品圖譜基線平穩(wěn)，供試品色譜圖中馬錢苷酸和龍膽苦苷能得到很好的分離，主峰前后無(wú)雜峰，保留時(shí)間比較適中。

該法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、分離度與穩(wěn)定性好、專屬性強(qiáng)，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：253.

[2] 張明燕，金琰琰，方成武.超高效液相色譜法測(cè)定四川松潘3種秦艽中馬錢苷酸和龍膽苦苷的含量[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，(6)：61-64.

[3] 曹曉燕，王政軍，王喆之.4種秦艽屬植物不同器官中4種環(huán)烯醚萜苷成分含量的比較分析[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2012，21(1)：58-63.

[4] 楊慧玲，司慶文，侯勤正，等.HPLC法測(cè)定不同海拔長(zhǎng)柄秦艽中馬錢苷酸、龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷[J].中草藥，2010，41(10)：1720-1722.

[5] 賈娜，張雅惠，王斌.麻花秦艽中馬錢苷酸和龍膽苦苷的含量測(cè)定及麻花秦艽藥材HPLC特征圖譜的研究[J].藥物分析雜志，2009,29(9)：185-189.

SimultaneousDeterminationofLoganinAcidandGentiopicrosideinTongfengdingTabletsbyHPLC

WANG Dongping*，YANXiaojun

(JilinInstituteforDrugControl，Changchun130033，China)

Objective：To establish a quality control method of Loganin acid and gentiopicroside in Tongfengding tablets.Methods：The column was Apollo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)and a mixture of methanol and 0.1% phosphoric acid solution(1∶4)as the mobile phase was adopted.The flow rate was 0.7 mL·min-1and the UV detection wavelength was 254 nm.Results：the linear range of Loganin acid was 0.095～0.855 μg(r=0.998 7).The average recovery was 98.73%，and the RSD was 2.01%(n=6).The linear range of gentiopicroside was 0.418～2.092 μg(r=0.999 9).The average recovery was 98.36%，and the RSD was 0.90%(n=6).Conclusion：The method was simple，accurate，good separation degree and stability and strong specificity，which could be used for the quality control of Tongfengding tablets.

Tongfengding tablets；HPLC；Loganic acid；Gentiopicroside；Content determination

2014-04-10)

*

王東平，主管藥師，研究方向：中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；Tel：(0431)84600508，E-mail：dpp_17@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.12.014