何鵬，王英，金建平，金陽(yáng)，吳敏

(1.蕪湖市食品藥品檢驗(yàn)所，安徽 蕪湖 241006；2.暨南大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510632)

HPLC同時(shí)測(cè)定廣東王不留行中綠原酸和蘆丁的含量

何鵬1*，王英2，金建平1，金陽(yáng)1，吳敏1

(1.蕪湖市食品藥品檢驗(yàn)所，安徽 蕪湖 241006；2.暨南大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510632)

目的：運(yùn)用高效液相色譜法(HPLC)建立廣東王不留行中綠原酸和蘆丁的含量測(cè)定方法。方法：色譜柱為Inersil ODS-3 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇(A)-1%醋酸水溶液(B)，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm，柱溫為40 ℃，流速為1.0 mL·min-1。結(jié)果：綠原酸在0.101 6～1.015 5 μg與峰面積線性關(guān)系良好(r=1.000 0，n=5)；蘆丁在0.021 5～0.214 9 μg與峰面積線性關(guān)系良好(r=1.000 0，n=5)。綠原酸的平均加樣回收率為98.3%，RSD=1.53%(n=6)；蘆丁的平均加樣回收率為102.9%，RSD=1.46%(n=6)。結(jié)論：所用方法操作簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確，可用于廣東王不留行的質(zhì)量控制。

廣東王不留行；綠原酸；蘆?。桓咝б合嗌V法

廣東王不留行為?？浦参镛道驠icuspumilaL.的干燥隱頭花序托，具有活血通經(jīng)、補(bǔ)腎固精功能，主治乳汁不下，陽(yáng)痿遺精，閉經(jīng)，久痢脫肛等[1]。主要分布于我國(guó)廣東、廣西、江蘇、四川等地[2]。廣東王不留行目前收載于《中國(guó)藥典》2010版一部附錄Ⅲ，未收載于標(biāo)準(zhǔn)正文中，《中國(guó)藥典》2015版一部正文擬將收載此品種。目前廣東王不留行中黃酮類(lèi)成分的含量測(cè)定研究已有報(bào)道[3]，但是同時(shí)測(cè)定綠原酸和蘆丁含量的文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用HPLC同時(shí)測(cè)定廣東王不留行中綠原酸和蘆丁兩種指標(biāo)成分，結(jié)果表明此法簡(jiǎn)便快捷，準(zhǔn)確可靠，為廣東王不留行的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀；Waters 2489紫外檢測(cè)器；JU-2106超聲波清洗器(上海杰恩普公司)；Mettler Toledo XP205電子分析天平(瑞士梅特勒托利多公司)；KEDA UV-VIS 8500紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(無(wú)錫科達(dá)公司)。

綠原酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量：96.6%，批號(hào)：110753-201314)；蘆丁對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量：90.5%，批號(hào)：100080-200707)；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純；廣東王不留行(共收集15批，產(chǎn)地均為廣東，批號(hào)：20130301，20130311，20130321，20130325，20130406，20130413，20130418，20130426，20130512，20130517，20130523，20130527，20130605，20130402，20130805)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Inersil ODS-3 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇(A)-1%醋酸水溶液(B)，梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1；檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm；柱溫為40 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)按蘆丁峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。在此條件下綠原酸峰和蘆丁峰與其他相鄰色譜峰均達(dá)到有效分離，分離度均大于1.5，見(jiàn)圖1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

A.綠原酸、蘆丁混合對(duì)照品 B.廣東王不留行樣品圖1 廣東王不留行樣品及對(duì)照品溶液HPLC圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對(duì)照品13.14 mg，置10 mL量瓶中，加入50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液(1.269 3 mg·mL-1)；精密稱取蘆丁對(duì)照品14.84 mg，置50 mL量瓶中，加入50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.268 6 mg·mL-1)；分別精密量取上述兩種儲(chǔ)備液各2 mL，置同一50 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液(其中綠原酸質(zhì)量濃度為0.050 8 mg·mL-1，蘆丁質(zhì)量濃度為0.010 7 mg·mL-1)。

2.3 供試品溶液的制備

取廣東王不留行粉末(過(guò)二號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)40 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液2，5，10，15，20 μL，注入高效液相色譜儀，按2.1色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，分別以綠原酸、蘆丁的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，繪制綠原酸和蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得綠原酸回歸方程：Y=2 787 075.756 5X-96 639.285 4(r=1.000 0)；蘆丁回歸方程：Y=1 747 157.771 8X-19 431.269 5(r=1.000 0)。綠原酸在0.101 6～1.015 5 μg、蘆丁在0.021 5～0.214 9 μg與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，照2.1色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸和蘆丁的RSD分別為0.65%和0.70%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取廣東不留行樣品(批號(hào)：20130301)1份，按2.3方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0，2，4，6，8 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸和蘆丁的RSD分別為0.64%和0.54%，表明供試品溶液室溫下至少在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(批號(hào)：20130301)6份，分別按2.3方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定含量。結(jié)果綠原酸和蘆丁的RSD分別為0.96%和1.43%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品(批號(hào)：20130301，綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)：0.271%，蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)：0.061%)6份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入一定量的綠原酸對(duì)照品和蘆丁對(duì)照品，按2.3方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2、3。

表2 廣東王不留行中綠原酸加樣回收試驗(yàn)

注：綠原酸對(duì)照品加入量均為1.269 3 mg

表3 廣東王不留行中蘆丁加樣回收試驗(yàn)

注：蘆丁對(duì)照品加入量均為0.268 6 mg

2.9 廣東王不留行樣品含量測(cè)定

取15批廣東王不留行樣品，按2.3方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定綠原酸及蘆丁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 廣東王不留行樣品中綠原酸及蘆丁的測(cè)定 %

3 討論

3.1 藥材名稱的考證

很多地方存在廣東王不留行與《中國(guó)藥典》2010版收載的石竹科藥材王不留行混用的情況，尤其在廣東、廣西、河南等地區(qū)習(xí)慣將廣東王不留行當(dāng)作王不留行使用[4]，在這些地區(qū)廣東王不留行常被稱為薜荔果、涼粉果、木饅頭、廣東王不留行[5]?！吨袊?guó)藥典》2015版將把廣東王不留行作為正式法定名稱，與石竹科的王不留行嚴(yán)格區(qū)分。

3.2流動(dòng)相的選擇

資料[6-8]，考察了不同比例的甲醇-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液、甲醇-1%冰醋酸水溶液、甲醇-水的多種等度和梯度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)等度洗脫運(yùn)行時(shí)間在40 min以上時(shí)綠原酸和蘆丁與各自相鄰峰的分離度才能大于1.5；選用磷酸時(shí)指標(biāo)成分拖尾因子略高于使用醋酸時(shí)得到的結(jié)果；以甲醇-1%冰醋酸水溶液按表1中規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫時(shí)綠原酸和蘆丁峰保留時(shí)間適中，基線平穩(wěn)，峰形理想，目標(biāo)成分峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，故按表1中的梯度程序作為流動(dòng)相。

3.3提取條件的選擇

本文首先考察了50%甲醇、甲醇、乙酸乙酯的提取效果，結(jié)果以50%甲醇-水溶液的提取效果最好；通過(guò)比較超聲提取法和加熱回流提取法，發(fā)現(xiàn)超聲提取效果較好且操作更簡(jiǎn)便；通過(guò)比較不同固液比(1∶25，1∶50，1∶75，1∶100)提取率，發(fā)現(xiàn)1∶25時(shí)提取效果差，后3個(gè)比例效果差別不大，從環(huán)保及節(jié)約試劑考慮，選擇加入溶劑量為50 mL；超聲時(shí)間考察了10，20 ，40，60 min，發(fā)現(xiàn)指標(biāo)成分含量隨著提取時(shí)間先增大后減小，當(dāng)超聲處理40 min時(shí)最大，故選擇超聲時(shí)間為40 min。

3.4檢測(cè)限和定量限

根據(jù)《中國(guó)藥典》2010版一部附錄XⅧ A中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的規(guī)定[6]，按照國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的《〈中國(guó)藥典〉中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究制定技術(shù)要求》、《〈中國(guó)藥典〉中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草與復(fù)核工作規(guī)范》和《〈中國(guó)藥典〉中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草說(shuō)明編寫(xiě)細(xì)則》等相關(guān)文件的要求，本研究未考察檢測(cè)限和定量限，而且標(biāo)準(zhǔn)曲線中濃度最低點(diǎn)的綠原酸和蘆丁峰面積分別為19萬(wàn)和2萬(wàn)左右，峰面積較大，可推算出檢測(cè)限和定量限非常小，沒(méi)有必要考察驗(yàn)證檢測(cè)限和定量限。

3.5含量的差異

本研究選擇了15批樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果個(gè)別批次含量偏差較大，分析可能的原因有：藥材來(lái)源于花序托即為薜荔果的果殼，體積較大，對(duì)取樣均勻性要求較高；果實(shí)的成熟度可能與含量也有著一定的關(guān)系；收集樣品過(guò)程中發(fā)現(xiàn)部分果殼內(nèi)帶有較多的種子，同一藥材中種子與果殼的含量也可能存在一定的差異。這些可能造成含量偏差的原因在今后的工作中將作進(jìn)一步的研究考證。

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SimultaneousDeterminationfortheContentofChlorogenicAcidandRutinintheSeedofVaccariasegetalisbyHPLC

HE Peng1*，WANGYing2，JINJianping1，JINYang1，WUMin1

(1.WuhuInstituteforFoodandDrugControl，Wuhu241006，China；2.CollegeofPharmacy，JinanUniversity，Guangzhou510562，China)

Objective：To establish a method for detecting the content of Chlorogenic acid and Rutin in the seed ofVaccariasegetalisby high performance liquid chromatography(HPLC).Methods：The sample was separated on the Inersil ODS-3 C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm),and was gradient elution using methanol(A)-1% acetic acid-water(B)as the mobile phase at a flow rate of 1.0 ml·min-1and at 40 ℃ of column temperature.The detection wavelength was 340 nm.Results：The linear range of Chlorogenic acid was at 0.101 6～1.015 5 μg(r=1.000 0，n=5)，and Rutin was at 0.021 5～0.214 9 μg(r=1.000 0，n=5).The average recovery rate was 98.3% for Chlorogenic acid，and the RSD was 1.53%(n=6).The average recovery rate was 102.9% for Rutin，and the RSD was 1.46%(n=6).Conclusion：This method is simple to handle，rapid and accurate，which can be used to control the quality for the seed ofVaccariasegetalis.

Vaccariasegetalis；Chlorogenic acid；Rutin；HPLC

2014-04-22)

*

何鵬，主管中藥師，研究方向：藥品標(biāo)準(zhǔn)和藥品檢驗(yàn)分析；Tel：(0553)5853053，E-mail：frankwade@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.12.007