吳飛燕，卿志星，曾建國，2*

(1.湖南中醫(yī)藥大學 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程 研究中心，湖南 長沙 410128)

研究開發(fā)

HPLC測定灰氈毛忍冬不同部位中綠原酸和木犀草苷的含量△

吳飛燕1，卿志星1，曾建國1，2*

(1.湖南中醫(yī)藥大學 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程 研究中心，湖南 長沙 410128)

目的：利用HPLC測定灰氈毛忍冬不同部位中綠原酸和木犀草苷的含量。方法：采用Agilent ZORBAX SB-phenyl C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.5%醋酸水溶液進行等度洗脫，檢測波長為350 nm，流速為1 mL·min-1，柱溫為25 ℃。結(jié)果：灰氈毛忍冬不同部位中綠原酸的含量為花>葉>枝；木犀草苷的含量為葉>花>枝。結(jié)論：本法簡便、靈敏、重復性好，可用于灰氈毛忍冬不同部位樣品中綠原酸和木犀草苷的含量測定。

灰氈毛忍冬；綠原酸；木犀草苷；高效液相色譜；含量測定

山銀花為傳統(tǒng)中藥材，具有清熱解毒，疏散風熱的功能?！吨袊幍洹?000年版及之前版本將山銀花作為金銀花收載，《中國藥典》2005年版之后將這兩個品種分開收載：山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.、紅腺忍冬LonicerahypoglaucaMiq.、華南忍冬LoniceramacranthoidesDC.或黃褐毛忍冬LonicerafulvotomentosaHsuet S.C.Cheng的干燥花蕾或帶初開的花。金銀花為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花[1]。2005版之前的《中國藥典》將綠原酸作為山銀花與金銀花的標示成分，而2005版之后的《中國藥典》將木犀草苷作為金銀花的另一標示成分，將灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙作為山銀花的標示成分。但據(jù)報道，目前山銀花中有許多新的改良變種，其木犀草苷的含量甚至超過了金銀花[2-3]，所以，以木犀草苷為特征成分已不能很好地區(qū)分金銀花和山銀花。山銀花在種植栽培過程中為了增產(chǎn)，需要在冬季和早春進行枝葉修整，這些枝葉產(chǎn)量較大，但長期以來都作為非藥用部分而未得到利用?；覛置潭巧姐y花中栽培面積最廣的品種，在湖南、四川等地均有大量栽培，全國種植面積有6萬公頃左右，為西南地區(qū)銀花藥材主流商品之一[4]。課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，灰氈毛忍冬枝葉中木犀草苷含量較高，為了合 理利用中藥資源，該實驗采用HPLC同時測定灰氈毛忍冬不同部位(枝、葉、花)綠原酸和木犀草苷的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Series高效液相色譜儀(G1311C二元高壓梯度泵，G1329B在線脫氣機，G1315D二極管陣列檢測器，Rev.B.04.03色譜工作站，美國Agilent)；AE240型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ5200DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；DHG-9246A型電熱恒溫干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；冷凍離心機(HERMLE 2323K，德國)；FW100型高速萬能粉碎機(天津市太斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥

綠原酸對照品(批號：110753-201314，純度：98%)、木犀草苷對照品(批號：111720-201106，純度：99.3%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇、乙醇均為色譜純，醋酸為分析純，水為Mili-Q超純水。

灰氈毛忍冬分別采自湖南辰溪、湖南麻陽、湖南隆回、重慶秀山，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學楊廣明教授鑒定為灰氈毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.的花、枝、葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱定綠原酸對照品27.0 mg于25 mL量瓶中，并用50%甲醇溶液溶解并定容，配制成濃度為1.08 mg·mL-1的綠原酸對照品溶液；精密稱定木犀草苷對照品10.3 mg于25 mL量瓶中，并用70%乙醇溶液溶解并定容，配制成濃度為0.412 mg·mL-1的木犀草苷對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

將灰氈毛忍冬樣品(枝、葉、花)殺青烘干(薄攤于烘箱內(nèi)，先于105 ℃條件下烘干5 min，再以60 ℃條件下烘烤至干)，粉碎過四號篩，取粉末2 g于100 mL具塞錐形瓶中，加70%甲醇50 mL密封，超聲提取(250 W，頻率35 kHz)60 min，離心，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-phenyl C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈(A)和0.5%醋酸溶液(B)進行等度洗脫(0～15 min：20%A)，流速：1 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測波長：350 nm；進樣量：10 μL。色譜圖見圖1。

A.混合對照品 B.灰氈毛忍冬葉(麻陽) 1.綠原酸 2.木犀草苷圖1 灰氈毛忍冬及對照品HPLC圖

2.4 線性范圍考察

分別精密吸取系列質(zhì)量濃度的對照品溶液10 μL，按2.3色譜條件進樣分析，以綠原酸、木犀草苷的峰面積為縱坐標(Y)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線，得線性回歸方程。綠原酸線性方程：Y=29 960X+14.382，r=0.999 8，結(jié)果表明綠原酸質(zhì)量濃度在0.002～0.295 6 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關系；木犀草苷線性方程：Y=29 067X-15.144，r=0.999 6，結(jié)果表明木犀草苷質(zhì)量濃度在0.001～0.099 3 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

取綠原酸和木犀草苷對照品溶液各10 μL進樣，平行進樣7次，記錄峰面積積分值，結(jié)果綠原酸和木犀草苷峰面積積分值的RSD分別為0.25%，0.11%。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密稱取同一批灰氈毛忍冬葉(辰溪)粉末2 g，按2.2項下方法制備供試品溶液，于0，2，4，6，8，10，12 h分別進樣10 μL，測得綠原酸和木犀草苷峰面積積分值的RSD分別為0.42%，0.46%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批灰氈毛忍冬葉(辰溪)粉末5份，每份約2 g，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別進樣10 μL，計算綠原酸和木犀草苷的平均質(zhì)量分數(shù)分別為2.080%，0.338%，結(jié)果綠原酸和木犀草苷質(zhì)量分數(shù)的RSD分別為1.45%，1.84%。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取同一批灰氈毛忍冬葉(辰溪)粉末6份，每份約0.5 g，分別精密加入綠原酸對照品溶液(1.08 mg·mL-1)10 mL和木犀草苷對照品溶液(0.42 mg·mL-1)4 mL。按2.2項下方法制備供試品溶液，分別進樣10 μL進行分析，結(jié)果見表1、2。

2.9 樣品測定

采集辰溪、麻陽、隆回、秀山4個產(chǎn)地的灰氈毛忍冬，分別取枝、葉、花3個不同的部位。按2.2項下方法制備供試品溶液，并按照上述色譜條件進行測定，分別計算不同產(chǎn)地灰氈毛忍冬不同部位中綠原酸和木犀草苷質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表3。

表1 灰氈毛忍冬中綠原酸加樣回收試驗

注：綠原酸對照品加入量均為10.80 mg

表2 灰氈毛忍冬中木犀草苷加樣回收試驗

注：木犀草苷對照品加入量均為1.68 mg

表3 灰氈毛忍冬中綠原酸和木犀草苷的測定 /%

3 討論

山銀花中主要的抑菌成分是綠原酸。現(xiàn)行《中國藥典》是以木犀草苷為特征成分區(qū)分金銀花和山銀花，所以本實驗對灰氈毛忍冬不同部位的綠原酸和木犀草苷同時進行含量測定。實驗結(jié)果表明，灰氈毛忍冬不同部位中綠原酸的含量為花>葉>枝，與趙成[5]得到的綠原酸含量測定結(jié)果(花>葉>莖)類似；灰氈毛忍冬花和葉的平均含量都大于2.5%，高于《中國藥典》山銀花項下綠原酸的限度要求(2.0%)；灰氈毛忍冬不同部位中木犀草苷的含量為葉>花>枝，有些產(chǎn)地的花中木犀草苷含量已經(jīng)達到《中國藥典》對金銀花的限度要求(0.05%)，王艷艷等[2]對不同產(chǎn)地的灰氈毛忍冬進行了木犀草苷的含量測定，其中有很多地區(qū)的含量也都超過了《中國藥典》的含量限度要求。所以，將木犀草苷作為金銀花的特征成分有待商榷。對于藥理作用方面，王林青等[6-7]用金銀花和山銀花進行體外抗偽狂犬病病毒(PRV)和新城疫病毒(NDV)試驗，發(fā)現(xiàn)兩者之間的抗病毒效果差異不顯著。因此，筆者建議，《中國藥典》將山銀花和金銀花分列為兩個品種應該進行進一步的實驗。

實驗結(jié)果顯示，灰氈毛忍冬的枝和葉均含有綠原酸和木犀草苷，其中葉中的綠原酸含量為花的40%左右，且葉中木犀草苷含量(0.294%)遠大于花(0.051 0%)。目前，已有相關文獻報道山銀花莖葉含有綠原酸，耿世磊等[8]利用熒光顯微鏡觀察到山銀花莖、葉及花中均分布有綠原酸。趙成[5]對山銀花不同器官進行了體外抗菌試驗，抑菌效果為葉>花蕾>莖>根。劉敏等[9]探討灰氈毛忍冬莖葉不同極性成分的體外抗氧化能力，結(jié)果表明，正丁醇提取物對DPPH自由基清除作用最強，推測其作用成分主要是綠原酸。 但目前還尚未見灰氈毛忍冬枝和葉中木犀草苷的相關藥理作用研究，本文可為此類研究提供相關參考。就實驗結(jié)果和文獻報道證明，灰氈毛忍冬的枝和葉具有一定的利用價值，民間目前也有將灰氈毛忍冬枝葉用于添加到豬飼料的習慣，灰氈毛忍冬種植過程中每年要進行多次枝葉修整，產(chǎn)量較大，可考慮將其利用到獸藥領域，比如加大灰氈毛忍冬枝葉用量來代替山銀花的花作為動物用藥，這樣不僅可以避免動物與人爭奪藥源，還可以綜合利用資源，提高農(nóng)戶的經(jīng)濟收入。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：28-29，205-206.

[2] 王艷艷，徐曉玉，鄧君，等.HPLC法同時測定灰氈毛忍冬中綠原酸與木犀草苷的含量[J].中藥材，2009，32(11)：1705-1707.

[3] 李錦燊，吳洪文.HPLC同時測定山銀花中綠原酸和木犀草苷的含量[J].北方藥學，2013，10(8)：10-11.

[4] 許小方，李會軍，李萍，等.灰氈毛忍冬花蕾中的化學成分[J].中國天然藥物，2006，4(1)：45.

[5] 趙成.山銀花不同器官的綠原酸含量及體外抑菌效果比較[J].安徽醫(yī)藥，2006，10(8)：584.

[6] 王林青，崔保安，張紅英.金銀花、山銀花黃酮類提取物體外偽狂犬病病毒作用研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(3)：183-187.

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[8] 耿世磊，徐鴻華，趙晟，等.山銀花莖、葉、花中綠原酸分布規(guī)律研究[J].中草藥，2004，35(3)：316-317.

[9] 劉敏，管福琴，王海婷.灰氈毛忍冬莖葉不同極性成分的體外抗氧化活性研究[J].食品科學，2012，37(4)：211-214.

HPLCDeterminationofChlorogenicAcidandGaluteolininDifferentPartsofLoniceramacranthoides

WU Feiyan1，QING Zhixing2，ZENG Jianguo1，2*

(1.HunanCo-InnovationCenterforUtilizationofBotanicalsFunctionalIngredients,HunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410208，China；2.NationalandLocalUnionEngineeringResearchCenterfortheVeterinaryHerbalmedicineresourcesandinitiative，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China)

Objective：To quantify chlorogenic acid and galuteolin in different parts ofLoniceramacranthoidesby HPLC method.Methods：The analysis was performed on Agilent ZORBAX SB-phenyl C18column (250mm×4.6mm，5μm).The mobile phase composed of acetonitrile-0.5% acetic acid aq.with isocratic elution.The detecting wavelength was350nm.The flow rate was1mL·min-1and the column temperature was25℃.Results：The chlorogenic acid content in different parts ofL.macranthoidesis flowers>leaves>branches.The galuteolin content is leaves>flowers>branches.Conclusion：The method is simple，sensitive and repeatability，which can be used for determining the content of chlorogenic acid and galuteolin in different parts ofL.macranthoides.

Loniceramacranthoides；Chlorogenic acid；Galuteolin；HPLC；Content determination

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.08.003

2014-02-20)

農(nóng)業(yè)行業(yè)標準制定與修訂(獸藥)(112203)，國家科技支撐計劃(2012BAI29B04)

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曾建國，教授，博士生導師，研究方向：中藥資源與中獸藥開發(fā)；Tel：(0731)84635293，E-mail：ginkgo@world-way.net