魏萬昆

【摘要】 目的：討論研究Profiler PlusTM、IdentifilerTM以及Powerplex16擴增試劑盒用于檢驗血樣DNA檢驗結(jié)果的差異，并研究其擴張不平衡和基因丟失現(xiàn)象的發(fā)生幾率。方法：選取150例完全無血緣關(guān)系的個體作為研究對象并采集其血樣，分別使用兩種擴增試劑盒進行檢驗。對所得不同結(jié)果的同一對象再使用3種擴增試劑盒進行檢驗。將檢驗所得結(jié)果進行比較。結(jié)果：3種試劑盒檢測的等位基因缺失率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。Profiler PlusTM檢測擴張不平衡率顯著高于其余兩種試劑盒（P<0.05）。結(jié)論：使用PCR擴增試劑盒對血樣DNA進行檢測時，會出現(xiàn)不同位置的異常基因，可表現(xiàn)為基因缺失及擴增不平衡。但Profiler PlusTM檢驗擴增不平衡發(fā)生率顯著高于其余兩種試劑盒。在實際生活對血樣DNA進行檢測時，除需準(zhǔn)備主要檢測擴增試劑盒外，還需準(zhǔn)備其他不同類備用試劑盒用于互相驗證及對比，盡量降低基因等位缺失及擴張不平衡發(fā)生率。

【關(guān)鍵詞】 不同PCR擴增試劑盒； 無血緣關(guān)系個體； 血樣DNA檢驗結(jié)果； 差異對比

【Abstract】 Objective：To discuss and study the difference between testing results of Profiler PlusTM， IdentifilerTM and Powerplex16 amplification kits in testing blood sample DNA， and study the occurrence rate of amplification imbalance and gene deletion phenomenon.Method：150 individuals who had no genetic connection with each other were chosen as research objects， and their blood samples were collected and tested by 2 different amplification kits. Objects with 2 different results were tested again by the third kit. All testing results were compared.Result：There were no significant differences between the 3 kits on allelic gene deletion （P<0.05）. Amplification imbalance rate of Profiler PlusTM was obviously higher than the other 2 kits （P<0.05）. Conclusion：When testing blood sample DNA with different PCR amplification kits， there might be abnormal genes of different positions which might manifested as gene deletion and amplification imbalance. But occurrence rate of amplification imbalance of testing result of Profiler PlusTM was obviously higher than the other 2 kits. In practical life， when testing blood sample DNA， besides major amplification kits， other different sorts of spare kits should be prepared for verification and comparison to reduce occurrence rates of allelic gene deletion and amplification imbalance.

【Key words】 Different PCR amplification kits； Individuals without genetic connection with each other； Blood sample DNA testing result； Difference comparison

First-authors address：The Second People's Hospital of Nanyang City，Nanyang 473000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.22.007

目前聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用到基因分離、克隆，核酸序列分析，疾病診斷、DNA檢驗等多個領(lǐng)域。該技術(shù)主要是指一種體外酶促合成特異DNA的方法。近年來DNA檢驗技術(shù)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中被廣泛使用，主要遺傳系統(tǒng)包括Profiler PlusTM、IdentifilerTM以及Powerplex16，可在各類犯罪案件、數(shù)據(jù)庫管理重建等項目中得到廣泛應(yīng)用[1-2]。大部分研究證明，使用這三種PCR擴增試劑盒漸漸結(jié)果科學(xué)性及可靠性高，具有較高的實用價值。但是該檢驗仍然會出現(xiàn)基因缺失或擴增不平衡現(xiàn)象。本實驗為研究不同擴增試劑盒用于檢驗血樣DNA結(jié)果的差異與臨床價值，特選取150例無血緣關(guān)系個體臨床資料進行分析?，F(xiàn)將報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取150例完全無血緣關(guān)系個體，所有個體均為漢族，其中男64例，女36例；年齡26～42歲，平均（34.3±8.2）歲。100例個體均來源于本次實驗的實驗室數(shù)據(jù)庫積累。設(shè)備儀器使用ABI公司提供ABI3100型基因分析儀以及9700型PPCR擴增儀器。endprint

1.2 實驗方法 對所有血樣采集檢驗個體均使用硅珠法進行提取DNA[3]。應(yīng)用10 μL擴增反應(yīng)體系應(yīng)用于PCR擴增。使用ABI-9700擴增儀進行擴增。反應(yīng)體系中成分以及熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置、檢測方法等根據(jù)儀器說明書進行設(shè)置及操作。Profiler PlusTM擴增試劑盒使用Rox-500內(nèi)標(biāo)；IdentifilerTM擴增試劑盒使用Liz-599內(nèi)標(biāo)；Powerplex16使用ILS-600內(nèi)標(biāo)。分析師分別使用Matrix順序為set F、set G5、set Z。分析軟件應(yīng)用GeneMapper ID v3.2分析軟件。使用相對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)階梯等位基因為標(biāo)準(zhǔn)進行基因型分型。對于IdentifilerTM以及Powerplex16擴增試劑盒加入0.05 ng、0.075 ng、1 ng至8 ng的9947A模版DNA進行擴增與檢測[4]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.5統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種擴增試劑盒等位基因確實及擴增不平衡比較 150例血液樣本中，2種不同種類擴增試劑盒不同檢驗結(jié)果分型為8例。檢驗差異率為8.0%。使用3種擴增試劑盒對上述8例血液樣本再次進行DNA血樣檢測后，Profiler PlusTM有1例于D8S1179基因座上出現(xiàn)等位基因缺失，IdentifilerTM在D13S317基因座上出現(xiàn)等位基因缺失，發(fā)生率均為2.0%。Powerplex16在D8S1179基因座上為7例擴增不平衡。其余兩種分別于D13S317以及FGA基因座上出現(xiàn)1例不平衡現(xiàn)象。不平衡概率為14.0%，2.0%以及2%。3種試劑盒檢測的等位基因缺失率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。Profiler PlusTM檢測擴張不平衡率顯著高于其余兩種試劑盒（P<0.05），見表1。

2.2 3種擴增試劑盒不同等位基因丟失現(xiàn)象的比較 實驗個體當(dāng)中Profiler PlusTM以及Powerplex16實際和檢驗存在7個樣本存在差異。在Profiler PlusTM試劑盒的D8S1179基因座位上發(fā)生擴增不平衡現(xiàn)象的5個樣本，經(jīng)IdentifilerTM以及Powerplex16試劑盒的擴增均表現(xiàn)為正常的雜合子分型，兩個等位基因的峰值比例相當(dāng)。由于3種反應(yīng)試劑盒對于同一個基因座在引物設(shè)計時選擇的側(cè)翼位置不一致，相應(yīng)的序列也有差異；且又由于點突變的緣故，部分個體的樣本在擴增時因與引物序列不匹配，相應(yīng)的等位基因不易擴增成功，或產(chǎn)量低，從而發(fā)生擴增不平衡，甚至等位基因缺失的現(xiàn)象，導(dǎo)致經(jīng)不同試劑盒擴增檢測后DNA分型不一致的現(xiàn)象。在本次試驗中，這種現(xiàn)象在Profiler PlusTM試劑盒中D8S1179基因座位上表現(xiàn)尤為明顯，5例擴增嚴(yán)重不平衡，雜合子的兩個等位基因峰值高度或峰面積差異在1：-1：5以上。IdentifilerTM以及Powerplex16兩種試劑盒在D8S1179基因座位上的引物設(shè)計選擇的側(cè)翼位置以及相應(yīng)的序列均有明顯改善，不容易發(fā)生與引物序列不匹配的情況。上述3種試劑盒各發(fā)生1例等位基因丟失的現(xiàn)象，等位基因丟失幾率均為0.1961%，但基因座不一樣，IdentifilerTM以及Profiler PlusTM均有同一例樣本在同一個基因座（D13S317）上丟失等位基因，應(yīng)為（8，12）的分型僅檢出（8）一個等位基因，相應(yīng)的Powerplex16有1例FGA基因座上發(fā)生缺失，應(yīng)為（22，24）的分型僅檢出（22）一個等位基因，而IdentifilerTM以及Profiler PlusTM均正常（圖1～2）。等位基因丟失或擴增不平衡現(xiàn)象的發(fā)生多數(shù)是由于引物序列不匹配造成，但還可能與退貨溫度偏高有關(guān)、或者由于其中一個等位基因片段太大沒能收集到數(shù)據(jù)，超出檢測范圍而造成的假象，如FGA基因座45.2等位基因。此外分析所有發(fā)生基因丟失或擴增不平衡現(xiàn)象基因座的STR分型，發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象均發(fā)生在大片段等位基因，而小片段等位基因不受影響（圖1～2）。這可能是由于大片段等位基因擴增效率角度，而小片段等位基因易與先擴增的緣故。

3 討論

由于Profiler PlusTM、IdentifilerTM以及Powerplex16在同一基因座上的引物側(cè)翼位置有所差異，因此易造成相應(yīng)的序列存在差異[5-7]。同時基因序列發(fā)生點突變可能導(dǎo)致樣本擴增時部分個體的序列以及引物序列不想匹配。導(dǎo)致相應(yīng)的等位基因擴增失敗或產(chǎn)物量較少，導(dǎo)致擴增不平衡及等位基因缺失現(xiàn)象。最終結(jié)果造成不同擴增試劑盒對血樣DNA檢驗分型不相一致。導(dǎo)致這兩種現(xiàn)象發(fā)生的原因也有可能是由于退火溫度較高或其中一個等位基因片段過大造成未對數(shù)據(jù)進行收集，導(dǎo)致超過檢驗范圍二出現(xiàn)的假象[8-10]。此外，對所有基因缺失及擴增不平衡現(xiàn)象基因座的STR分型后發(fā)現(xiàn)，此類表現(xiàn)均體現(xiàn)在較大片段等位基因中，對小片段不造成較大影響。這一現(xiàn)象原因是小片段等位基因其擴增率相對較低且易于優(yōu)先擴增[11-12]。

本次實驗對Profiler PlusTM及Powerplex16分別加入不同劑量9947A模版DNA進行擴增及監(jiān)測。檢驗結(jié)果顯示兩種不同擴增試劑盒擴增所需的模版DNA量為1～3 ng。最低靈敏度為0.075 ng。但模版上限IdentifilerTM為5 ng，Powerplex16則高達8 ng。實驗結(jié)果分析得出IdentifilerTM及Powerplex16對模版DNA量大小無明顯差異，因此在實際應(yīng)用中可類同把握。對于DNA降解程度的適應(yīng)性尚未明確顯示。

綜上所述，使用3種不同擴增試劑盒均會出現(xiàn)等位基因丟失及擴張不平衡現(xiàn)象。但Profiler PlusTM其發(fā)生率顯著高于其余兩種試劑盒。因此，在實際檢驗操作過程中可選擇主要一類擴增試劑盒，其異常百分比可相對較低。另外需再準(zhǔn)備一至兩種試劑盒作為對比分析時可進行檢測，盡量減少兩種差異所造成判斷類型錯誤發(fā)生。

參考文獻

[1]吳微微，郝宏蕾，林錦鋒，等.3種國產(chǎn)化試劑盒與Identifiler-（TM）試劑盒檢驗結(jié)果比較[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2011，11（1）：45-47.

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[5]申琴，倪斌，歐陽曙明，等.湖南地區(qū)1013例親子鑒定中的STR突變位點研究[J].生命科學(xué)研究，2009，11（6）：517-520

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[12]吳澤建，王惠斌，袁錫裕.RT-PCR檢測CK19 mRNA青年結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，11（07）：6-8.

（收稿日期：2014-03-12） （本文編輯：蔡元元）endprint

1.2 實驗方法 對所有血樣采集檢驗個體均使用硅珠法進行提取DNA[3]。應(yīng)用10 μL擴增反應(yīng)體系應(yīng)用于PCR擴增。使用ABI-9700擴增儀進行擴增。反應(yīng)體系中成分以及熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置、檢測方法等根據(jù)儀器說明書進行設(shè)置及操作。Profiler PlusTM擴增試劑盒使用Rox-500內(nèi)標(biāo)；IdentifilerTM擴增試劑盒使用Liz-599內(nèi)標(biāo)；Powerplex16使用ILS-600內(nèi)標(biāo)。分析師分別使用Matrix順序為set F、set G5、set Z。分析軟件應(yīng)用GeneMapper ID v3.2分析軟件。使用相對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)階梯等位基因為標(biāo)準(zhǔn)進行基因型分型。對于IdentifilerTM以及Powerplex16擴增試劑盒加入0.05 ng、0.075 ng、1 ng至8 ng的9947A模版DNA進行擴增與檢測[4]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.5統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種擴增試劑盒等位基因確實及擴增不平衡比較 150例血液樣本中，2種不同種類擴增試劑盒不同檢驗結(jié)果分型為8例。檢驗差異率為8.0%。使用3種擴增試劑盒對上述8例血液樣本再次進行DNA血樣檢測后，Profiler PlusTM有1例于D8S1179基因座上出現(xiàn)等位基因缺失，IdentifilerTM在D13S317基因座上出現(xiàn)等位基因缺失，發(fā)生率均為2.0%。Powerplex16在D8S1179基因座上為7例擴增不平衡。其余兩種分別于D13S317以及FGA基因座上出現(xiàn)1例不平衡現(xiàn)象。不平衡概率為14.0%，2.0%以及2%。3種試劑盒檢測的等位基因缺失率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。Profiler PlusTM檢測擴張不平衡率顯著高于其余兩種試劑盒（P<0.05），見表1。

2.2 3種擴增試劑盒不同等位基因丟失現(xiàn)象的比較 實驗個體當(dāng)中Profiler PlusTM以及Powerplex16實際和檢驗存在7個樣本存在差異。在Profiler PlusTM試劑盒的D8S1179基因座位上發(fā)生擴增不平衡現(xiàn)象的5個樣本，經(jīng)IdentifilerTM以及Powerplex16試劑盒的擴增均表現(xiàn)為正常的雜合子分型，兩個等位基因的峰值比例相當(dāng)。由于3種反應(yīng)試劑盒對于同一個基因座在引物設(shè)計時選擇的側(cè)翼位置不一致，相應(yīng)的序列也有差異；且又由于點突變的緣故，部分個體的樣本在擴增時因與引物序列不匹配，相應(yīng)的等位基因不易擴增成功，或產(chǎn)量低，從而發(fā)生擴增不平衡，甚至等位基因缺失的現(xiàn)象，導(dǎo)致經(jīng)不同試劑盒擴增檢測后DNA分型不一致的現(xiàn)象。在本次試驗中，這種現(xiàn)象在Profiler PlusTM試劑盒中D8S1179基因座位上表現(xiàn)尤為明顯，5例擴增嚴(yán)重不平衡，雜合子的兩個等位基因峰值高度或峰面積差異在1：-1：5以上。IdentifilerTM以及Powerplex16兩種試劑盒在D8S1179基因座位上的引物設(shè)計選擇的側(cè)翼位置以及相應(yīng)的序列均有明顯改善，不容易發(fā)生與引物序列不匹配的情況。上述3種試劑盒各發(fā)生1例等位基因丟失的現(xiàn)象，等位基因丟失幾率均為0.1961%，但基因座不一樣，IdentifilerTM以及Profiler PlusTM均有同一例樣本在同一個基因座（D13S317）上丟失等位基因，應(yīng)為（8，12）的分型僅檢出（8）一個等位基因，相應(yīng)的Powerplex16有1例FGA基因座上發(fā)生缺失，應(yīng)為（22，24）的分型僅檢出（22）一個等位基因，而IdentifilerTM以及Profiler PlusTM均正常（圖1～2）。等位基因丟失或擴增不平衡現(xiàn)象的發(fā)生多數(shù)是由于引物序列不匹配造成，但還可能與退貨溫度偏高有關(guān)、或者由于其中一個等位基因片段太大沒能收集到數(shù)據(jù)，超出檢測范圍而造成的假象，如FGA基因座45.2等位基因。此外分析所有發(fā)生基因丟失或擴增不平衡現(xiàn)象基因座的STR分型，發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象均發(fā)生在大片段等位基因，而小片段等位基因不受影響（圖1～2）。這可能是由于大片段等位基因擴增效率角度，而小片段等位基因易與先擴增的緣故。

3 討論

由于Profiler PlusTM、IdentifilerTM以及Powerplex16在同一基因座上的引物側(cè)翼位置有所差異，因此易造成相應(yīng)的序列存在差異[5-7]。同時基因序列發(fā)生點突變可能導(dǎo)致樣本擴增時部分個體的序列以及引物序列不想匹配。導(dǎo)致相應(yīng)的等位基因擴增失敗或產(chǎn)物量較少，導(dǎo)致擴增不平衡及等位基因缺失現(xiàn)象。最終結(jié)果造成不同擴增試劑盒對血樣DNA檢驗分型不相一致。導(dǎo)致這兩種現(xiàn)象發(fā)生的原因也有可能是由于退火溫度較高或其中一個等位基因片段過大造成未對數(shù)據(jù)進行收集，導(dǎo)致超過檢驗范圍二出現(xiàn)的假象[8-10]。此外，對所有基因缺失及擴增不平衡現(xiàn)象基因座的STR分型后發(fā)現(xiàn)，此類表現(xiàn)均體現(xiàn)在較大片段等位基因中，對小片段不造成較大影響。這一現(xiàn)象原因是小片段等位基因其擴增率相對較低且易于優(yōu)先擴增[11-12]。

本次實驗對Profiler PlusTM及Powerplex16分別加入不同劑量9947A模版DNA進行擴增及監(jiān)測。檢驗結(jié)果顯示兩種不同擴增試劑盒擴增所需的模版DNA量為1～3 ng。最低靈敏度為0.075 ng。但模版上限IdentifilerTM為5 ng，Powerplex16則高達8 ng。實驗結(jié)果分析得出IdentifilerTM及Powerplex16對模版DNA量大小無明顯差異，因此在實際應(yīng)用中可類同把握。對于DNA降解程度的適應(yīng)性尚未明確顯示。

綜上所述，使用3種不同擴增試劑盒均會出現(xiàn)等位基因丟失及擴張不平衡現(xiàn)象。但Profiler PlusTM其發(fā)生率顯著高于其余兩種試劑盒。因此，在實際檢驗操作過程中可選擇主要一類擴增試劑盒，其異常百分比可相對較低。另外需再準(zhǔn)備一至兩種試劑盒作為對比分析時可進行檢測，盡量減少兩種差異所造成判斷類型錯誤發(fā)生。

參考文獻

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[4]吳微微，劉振平，傅汀，等.3種常用PCR擴增試劑盒檢驗血樣DNA的結(jié)果比較[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2006，12（4）：203-207.

[5]申琴，倪斌，歐陽曙明，等.湖南地區(qū)1013例親子鑒定中的STR突變位點研究[J].生命科學(xué)研究，2009，11（6）：517-520

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[8]劉超，李越，王穗保.廣州地區(qū)漢族人群Penta D及Penta E STR基因座頻率[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2001，13（3）：101-102.

[9]劉翠蘭，胡家偉，朱傳紅.Profiler Plus試劑盒擴增Amelogenin基因座變異一例[J].刑事技術(shù)，2005，13（4）：25-27.

[10]王軍，邢錦山.連云港地區(qū)漢族人群15個STR基因座的遺傳多態(tài)性[J].蘇州大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2010，30（2）：106-108.

[11]胡玉弘，陳玲玲，馮軍.標(biāo)本存放時間對熒光定量PCR檢測HBV-DNA結(jié)果的影響[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2010，7（2）：7-8.

[12]吳澤建，王惠斌，袁錫裕.RT-PCR檢測CK19 mRNA青年結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，11（07）：6-8.

（收稿日期：2014-03-12） （本文編輯：蔡元元）endprint

1.2 實驗方法 對所有血樣采集檢驗個體均使用硅珠法進行提取DNA[3]。應(yīng)用10 μL擴增反應(yīng)體系應(yīng)用于PCR擴增。使用ABI-9700擴增儀進行擴增。反應(yīng)體系中成分以及熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置、檢測方法等根據(jù)儀器說明書進行設(shè)置及操作。Profiler PlusTM擴增試劑盒使用Rox-500內(nèi)標(biāo)；IdentifilerTM擴增試劑盒使用Liz-599內(nèi)標(biāo)；Powerplex16使用ILS-600內(nèi)標(biāo)。分析師分別使用Matrix順序為set F、set G5、set Z。分析軟件應(yīng)用GeneMapper ID v3.2分析軟件。使用相對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)階梯等位基因為標(biāo)準(zhǔn)進行基因型分型。對于IdentifilerTM以及Powerplex16擴增試劑盒加入0.05 ng、0.075 ng、1 ng至8 ng的9947A模版DNA進行擴增與檢測[4]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.5統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種擴增試劑盒等位基因確實及擴增不平衡比較 150例血液樣本中，2種不同種類擴增試劑盒不同檢驗結(jié)果分型為8例。檢驗差異率為8.0%。使用3種擴增試劑盒對上述8例血液樣本再次進行DNA血樣檢測后，Profiler PlusTM有1例于D8S1179基因座上出現(xiàn)等位基因缺失，IdentifilerTM在D13S317基因座上出現(xiàn)等位基因缺失，發(fā)生率均為2.0%。Powerplex16在D8S1179基因座上為7例擴增不平衡。其余兩種分別于D13S317以及FGA基因座上出現(xiàn)1例不平衡現(xiàn)象。不平衡概率為14.0%，2.0%以及2%。3種試劑盒檢測的等位基因缺失率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。Profiler PlusTM檢測擴張不平衡率顯著高于其余兩種試劑盒（P<0.05），見表1。

2.2 3種擴增試劑盒不同等位基因丟失現(xiàn)象的比較 實驗個體當(dāng)中Profiler PlusTM以及Powerplex16實際和檢驗存在7個樣本存在差異。在Profiler PlusTM試劑盒的D8S1179基因座位上發(fā)生擴增不平衡現(xiàn)象的5個樣本，經(jīng)IdentifilerTM以及Powerplex16試劑盒的擴增均表現(xiàn)為正常的雜合子分型，兩個等位基因的峰值比例相當(dāng)。由于3種反應(yīng)試劑盒對于同一個基因座在引物設(shè)計時選擇的側(cè)翼位置不一致，相應(yīng)的序列也有差異；且又由于點突變的緣故，部分個體的樣本在擴增時因與引物序列不匹配，相應(yīng)的等位基因不易擴增成功，或產(chǎn)量低，從而發(fā)生擴增不平衡，甚至等位基因缺失的現(xiàn)象，導(dǎo)致經(jīng)不同試劑盒擴增檢測后DNA分型不一致的現(xiàn)象。在本次試驗中，這種現(xiàn)象在Profiler PlusTM試劑盒中D8S1179基因座位上表現(xiàn)尤為明顯，5例擴增嚴(yán)重不平衡，雜合子的兩個等位基因峰值高度或峰面積差異在1：-1：5以上。IdentifilerTM以及Powerplex16兩種試劑盒在D8S1179基因座位上的引物設(shè)計選擇的側(cè)翼位置以及相應(yīng)的序列均有明顯改善，不容易發(fā)生與引物序列不匹配的情況。上述3種試劑盒各發(fā)生1例等位基因丟失的現(xiàn)象，等位基因丟失幾率均為0.1961%，但基因座不一樣，IdentifilerTM以及Profiler PlusTM均有同一例樣本在同一個基因座（D13S317）上丟失等位基因，應(yīng)為（8，12）的分型僅檢出（8）一個等位基因，相應(yīng)的Powerplex16有1例FGA基因座上發(fā)生缺失，應(yīng)為（22，24）的分型僅檢出（22）一個等位基因，而IdentifilerTM以及Profiler PlusTM均正常（圖1～2）。等位基因丟失或擴增不平衡現(xiàn)象的發(fā)生多數(shù)是由于引物序列不匹配造成，但還可能與退貨溫度偏高有關(guān)、或者由于其中一個等位基因片段太大沒能收集到數(shù)據(jù)，超出檢測范圍而造成的假象，如FGA基因座45.2等位基因。此外分析所有發(fā)生基因丟失或擴增不平衡現(xiàn)象基因座的STR分型，發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象均發(fā)生在大片段等位基因，而小片段等位基因不受影響（圖1～2）。這可能是由于大片段等位基因擴增效率角度，而小片段等位基因易與先擴增的緣故。

3 討論

由于Profiler PlusTM、IdentifilerTM以及Powerplex16在同一基因座上的引物側(cè)翼位置有所差異，因此易造成相應(yīng)的序列存在差異[5-7]。同時基因序列發(fā)生點突變可能導(dǎo)致樣本擴增時部分個體的序列以及引物序列不想匹配。導(dǎo)致相應(yīng)的等位基因擴增失敗或產(chǎn)物量較少，導(dǎo)致擴增不平衡及等位基因缺失現(xiàn)象。最終結(jié)果造成不同擴增試劑盒對血樣DNA檢驗分型不相一致。導(dǎo)致這兩種現(xiàn)象發(fā)生的原因也有可能是由于退火溫度較高或其中一個等位基因片段過大造成未對數(shù)據(jù)進行收集，導(dǎo)致超過檢驗范圍二出現(xiàn)的假象[8-10]。此外，對所有基因缺失及擴增不平衡現(xiàn)象基因座的STR分型后發(fā)現(xiàn)，此類表現(xiàn)均體現(xiàn)在較大片段等位基因中，對小片段不造成較大影響。這一現(xiàn)象原因是小片段等位基因其擴增率相對較低且易于優(yōu)先擴增[11-12]。

本次實驗對Profiler PlusTM及Powerplex16分別加入不同劑量9947A模版DNA進行擴增及監(jiān)測。檢驗結(jié)果顯示兩種不同擴增試劑盒擴增所需的模版DNA量為1～3 ng。最低靈敏度為0.075 ng。但模版上限IdentifilerTM為5 ng，Powerplex16則高達8 ng。實驗結(jié)果分析得出IdentifilerTM及Powerplex16對模版DNA量大小無明顯差異，因此在實際應(yīng)用中可類同把握。對于DNA降解程度的適應(yīng)性尚未明確顯示。

綜上所述，使用3種不同擴增試劑盒均會出現(xiàn)等位基因丟失及擴張不平衡現(xiàn)象。但Profiler PlusTM其發(fā)生率顯著高于其余兩種試劑盒。因此，在實際檢驗操作過程中可選擇主要一類擴增試劑盒，其異常百分比可相對較低。另外需再準(zhǔn)備一至兩種試劑盒作為對比分析時可進行檢測，盡量減少兩種差異所造成判斷類型錯誤發(fā)生。

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（收稿日期：2014-03-12） （本文編輯：蔡元元）endprint