胡繼松，陳靜萍，陳 亮，武小芬，王克勤 ，劉仲華

（1.湖南省核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

芹菜（Apium grauveolens L.）是人們經(jīng)常食用的一種保健型蔬菜[1]。大量研究表明，芹菜中含有黃酮類化合物（芹菜素、芹菜苷）、α-芹子烯、β-芹子烯、多種脂肪酸等生物活性成分[2-4]，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、緩解視力疲勞、降脂、降壓、阻滯癌細(xì)胞增殖、抑制雌激素和孕激素分泌等作用[5]。肝臟X受體（LXR）和膽汁酸受體（FXR）是編碼轉(zhuǎn)錄因子的核受體超基因家族成員，在膽汁酸和膽固醇代謝過程中起調(diào)節(jié)作用，并與多種代謝性疾病密切相關(guān)[6]。研究旨在通過細(xì)胞模型確定芹菜中黃酮類化合物的藥理活性，為芹菜開發(fā)新型天然黃酮類藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

芹菜素、芹菜苷、3′-甲氧基芹菜苷，純度均為98%，芹菜醇提物（黃酮含量40%）和芹菜粗黃酮（黃酮含量70%）均為實(shí)驗(yàn)室自制樣品。

SMMC-7721細(xì)胞株、肝癌細(xì)胞株HepG2、白血病細(xì)胞株HL-60、LXR細(xì)胞模型、FXR激活和抑制細(xì)胞模型均由深圳微芯公司提供；磷酸鹽緩沖液（PBS）、杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS）、培養(yǎng)液和消化液購自Hyclone公司；二甲亞砜（DMSO）購自美國(guó)Sigma公司；甲臢化合物（MTS）和吩嗪硫酸二甲酯（PMS）購自Promega公司；FuGENE6試劑盒購自羅氏公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自Falcon公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞活性測(cè)定 以SMMC-7721細(xì)胞株為材料，采用四氮唑鹽酶還原法（MTS）進(jìn)行細(xì)胞活性測(cè)定。細(xì)胞根據(jù)董新榮等[7]的方法進(jìn)行培養(yǎng)，稀釋至適宜濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。在96孔板中每孔分別加入100 μL細(xì)胞液，于37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)約24 h，棄去培養(yǎng)液，補(bǔ)加190 μL新鮮培養(yǎng)液；按表1的濃度添加各受試藥物10 μL，同時(shí)以添加相應(yīng)體積的培養(yǎng)液和5-氟尿嘧啶分別作為陰性對(duì)照和陽性藥物對(duì)照，混勻后培養(yǎng)48 h后取出，吸出孔中培養(yǎng)液；另外加入培養(yǎng)液60 μL與MTS、PMS的混合液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)，2 h后取出在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光值。

細(xì)胞活性計(jì)算公式：細(xì)胞活性=（A樣-A陰）/（A陽-A陰） （1）

式中，A樣、A陽和A陰分別為樣品組、添加陽性藥物溶液對(duì)照組和陰性對(duì)照組在490 nm處的吸光值。根據(jù)公式（1）計(jì)算出細(xì)胞活性，確定后續(xù)試驗(yàn)加藥濃度。

表1 MTS加藥濃度試驗(yàn)方案 （μg/m L）Table 1 Design of adding sample concentrations for MTS

1.2.2 藥物活性的高通量篩選 LXR、FXR核受體模型的試驗(yàn)：第1 d每孔種20 000個(gè)肝癌細(xì)胞，培養(yǎng)體系100 μL，采用FuGENE6試劑盒法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中；第2 d棄去原有100 μL培養(yǎng)液，再加入200 μL新鮮培養(yǎng)液，同時(shí)按1.2.1確定的濃度加入相應(yīng)的藥物；第3 d檢測(cè)熒光酶強(qiáng)度（Luciferase）和轉(zhuǎn)染效率（GFP）。HepG2和HL-60腫瘤細(xì)胞模型的試驗(yàn)：第1 d每孔分別種HepG2、HL-60細(xì)胞30 000個(gè)，培養(yǎng)體系為190 μL；第2 d按表2進(jìn)行加藥試驗(yàn)；第4 d加入MTS與PMS的混合液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 2 h后取出在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光值。

1.2.3 受試藥物對(duì)模型效果的檢測(cè) 取出細(xì)胞培養(yǎng)板，吸出孔中培養(yǎng)液并用PBS清洗細(xì)胞，然后加入80 μL的細(xì)胞裂解液（裂解液稀釋5倍后使用），混勻后靜置5 min。其中，取20 μL裂解后的細(xì)胞液用黑板測(cè)熒光酶強(qiáng)度；取50 μL裂解后的細(xì)胞液用黑板測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。避光條件下每孔加入50 μL 熒光酶強(qiáng)度底物，立即于485 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。細(xì)胞接種數(shù)量、化合物毒性及轉(zhuǎn)染效率等因素造成的誤差采用同時(shí)共轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒（試驗(yàn)內(nèi)參）來較正。試驗(yàn)結(jié)果的熒光酶強(qiáng)度均采用轉(zhuǎn)染效率值進(jìn)行校正。轉(zhuǎn)染效率測(cè)定時(shí)不再加入任何試劑，直接用熒光超微板檢測(cè)于在527 nm處檢測(cè)其吸光值。LXR、FXR模型試驗(yàn)結(jié)果通過相對(duì)激活倍數(shù)來表示，其中溶劑對(duì)照值為1，值越大則說明樣品激活能力越高。

激活倍數(shù)=（LUC樣品/GFP樣品）/ （LUC空白/GFP空白） （2）

表2 腫瘤細(xì)胞模型（HepG2、HL-60）生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)加藥方案 （μg/m L）Table 2 Design of adding sample for screening agonist experiment

溶劑陽性對(duì)照組激活倍數(shù)為4.21，值越小說明抑制能力越強(qiáng)。所有試驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物添加濃度的確定

藥物添加濃度過高會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性而損傷細(xì)胞，濃度過低會(huì)導(dǎo)致表達(dá)效果不清晰。試驗(yàn)結(jié)果表明，陽性藥物對(duì)照組的細(xì)胞值為1.00，無細(xì)胞陰性對(duì)照組的細(xì)胞值為0，樣品值低于0.80被確認(rèn)為能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，樣品值在0.80以上則被認(rèn)為基本不抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，其中值越小說明抑制程度越高。由表3可知，當(dāng)藥物濃度為10 μg/m L時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)基本不受抑制，但是當(dāng)濃度提高至30 μg/m L以上時(shí)，芹菜素明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此為了便于藥品間的比較，最終所有藥物的添加濃度均確定為10 μg/m L。

表3 添加不同濃度藥物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞株細(xì)胞活性的影響 Table 3 Effect of adding different concentrations of drugs on cell activity in SMMC-7721 cell line

2.2 芹菜黃酮類物質(zhì)對(duì)LXR核受體模型的效果

LXR是代謝疾病治療的靶點(diǎn)之一，對(duì)脂代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有重要作用。采用相對(duì)激活倍數(shù)來評(píng)價(jià)LXR模型的試驗(yàn)結(jié)果，其中溶劑對(duì)照組的激活值為1.00；當(dāng)樣品激活值≥1.00，說明有激活效果；激活值≥1.50，說明激活效果顯著；值越大則激活能力越高。由圖1可知，5種芹菜黃酮類物質(zhì)對(duì)LXR受體模型均表現(xiàn)出不同程度的活性，其中芹菜素和芹菜醇提物激活效果顯著，激活值分別為2.22和1.54。5種芹菜黃酮類物質(zhì)對(duì)LXR核受體模型的激活順序?yàn)椋呵鄄怂兀厩鄄舜继嵛铮厩鄄舜贮S酮＞3′-甲氧基芹菜苷＞芹菜苷。

2.3 芹菜黃酮類物質(zhì)對(duì)FXR核受體模型的效果

圖1 芹菜黃酮類物質(zhì)對(duì)LXR核受體模型高通量篩選結(jié)果Fig.1 The result of celery flavonoids on LXR by HTS

FXR通過影響膽汁酸的生物合成從而調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇代謝。由圖2可知，僅芹菜苷樣品的激活值低于1.00，其他藥物的激活值均高于1.00。這表明芹菜素、3′-甲氧基芹菜苷、芹菜醇提物、芹菜粗黃酮對(duì)FXR核受體模型有一定的激活活性。其中，芹菜素的激活效果最佳，激活值為1.15，說明芹菜素具有增加FXR受體敏感性的作用。同時(shí)，以鵝去氧膽酸為對(duì)照，該物質(zhì)對(duì)FXR核受體模型有一定的抑制作用，因此藥物的誘導(dǎo)值越小則抑制作用越強(qiáng)。從圖2中可以看出，5種芹菜黃酮類物質(zhì)對(duì)FXR抑制模型的作用值均大于鵝去氧膽酸的誘導(dǎo)倍數(shù)（4.21），這說明5種芹菜黃酮類物質(zhì)對(duì)FXR核受體模型無明顯抑制作用。

圖2 芹菜黃酮類物質(zhì)對(duì)FXR核受體模型的高通量篩選結(jié)果Fig.2 The result of theafl avins on FXR by HTS

2.4 芹菜黃酮類物質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞模型HepG 2和HL-60的效果

黃色新型甲臢化合物能夠被活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為甲臜，生成甲臢的量與培養(yǎng)物中活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可根據(jù)甲臢的吸光度值推算出活細(xì)胞數(shù)目，從而評(píng)價(jià)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制或殺傷的能力。在MTS試驗(yàn)中，陰性對(duì)照和陽性藥物對(duì)照組活的細(xì)胞數(shù)量分別為0和1.00，以此為依據(jù)計(jì)算出受試樣品組活細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。當(dāng)數(shù)值低于0.50時(shí)，說明藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有重度抑制作用；數(shù)值在0.50～0.80之間時(shí)，表示藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有輕度抑制作用；數(shù)值高于0.8時(shí)，則表示藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)不具抑制效果。

從表4和表5中可以看出，當(dāng)藥物的添加濃度為100 μg/m L時(shí)，芹菜素和芹菜醇提物對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和HL-60白血病細(xì)胞均具有重度抑制作用，其中這兩種物質(zhì)對(duì)肝癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（GI50）分別為3.31 μg/m L和66.07 μg/m L，對(duì)白血病細(xì)胞的GI50分別為1.62 μg/m L和44.67 μg/m L。這說明這兩種芹菜黃酮類物質(zhì)對(duì)治療肝癌和白血病都有一定的藥理活性。而芹菜苷、3′-甲氧基芹菜苷、芹菜粗黃酮對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞和HL-60白血病細(xì)胞篩選數(shù)值均大于0.8，GI50均大于100，則說明這三種藥物基本不抑制肝癌細(xì)胞和白細(xì)胞的生長(zhǎng)。

表4 芹菜黃酮類物質(zhì)對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的高通量篩選結(jié)果Table 4 The result of celery fiavonoids on Hep G2 by HTS

表5 芹菜黃酮類物質(zhì)對(duì)HL-60白血病細(xì)胞高通量篩選結(jié)果Table 5 The result of celery fiavonoids on HL-60 by HTS

3 結(jié)論與討論

研究采用高通量篩選技術(shù)，通過LXR模型、FXR激活和抑制模型來研究芹菜黃酮類物質(zhì)對(duì)代謝綜合癥的作用效果。結(jié)果表明，當(dāng)樣品濃度為10 μg/m L，芹菜素在LXR受體模型上表現(xiàn)出一定的活性，并可有效提高FXR受體模型的敏感性，從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)一步惡化，降低心血管疾病的發(fā)生幾率。同時(shí)，通過激活LXR模型可增加膽固醇從肝臟的排出量，從而減少小腸對(duì)膽固醇的吸收，進(jìn)而調(diào)節(jié)血脂水平。這一結(jié)果與夏藿、梁華等[8-9]的研究結(jié)果一致，表明芹菜提取物具有降血脂的效果。

5種芹菜黃酮類化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果表現(xiàn)出較大差異。芹菜素和芹菜醇提物樣品對(duì)HepG2和HL-60有一定的抑制作用。當(dāng)濃度為100 μg/m L時(shí)，芹菜素和芹菜醇提物抑制HepG2的GI50值分別為3.31 μg/m L和66.07 μg/m L，抑制HL-60的GI50值分別為1.62 μg/m L和44.67 μg/m L。該結(jié)果與Gao、胡太平等[10]的研究結(jié)果相似。而試驗(yàn)中芹菜粗黃酮、芹菜苷、3′-甲氧基芹菜苷對(duì)HepG2和HL-60這兩種腫瘤細(xì)胞均無明顯抑制效果，這與他人的研究結(jié)果有一定的差異。這可能與試驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度以及所選取的腫瘤細(xì)胞有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

[1]劉詠松.芹菜的本草研究及功用[J].四川中醫(yī)，2004，22（7）：25-26.

[2]劉佳微，李芝蘭，劉玲飛，等.芹菜素對(duì)雄性小鼠肝臟功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2014，24（2）：29-33.

[3]張 偉，李福榮.芹菜籽提取物誘導(dǎo)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，（12）：887-889.

[4]張捷莉.兩種不同芹菜籽油中脂肪酸的GC/MS分析[J].中國(guó)油脂，2004，29（6）：70-71.

[5]歷 強(qiáng)，馬建倉.芹菜素的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊(cè)，2003，25（3）：147-149.

[6]秦 儉，韓天權(quán)，張圣道.核受體LXR和FXR對(duì)脂類代謝的調(diào)節(jié)[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊(cè)，2005，32（3）：223-226.

[7]董新榮，劉仲華.高通量篩選辣椒素與辣椒素酯生物活性的初步研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2009，9（2）：5-10.

[8]夏 藿，隋煥平，邱 雋.芹菜提取物對(duì)喂飼高脂飼料大鼠血脂的影響[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，2001，17（4）：337-338.

[9]梁 華，夏 薇，苑林宏，等.芹菜提取物對(duì)自發(fā)高血壓大鼠血壓及高脂模型大鼠血脂的影響[J].疾病控制雜志， 2005，9（2） ：97-99.

[10]Gao H，Liu B G，Liu F，et al.Anti-Proliferative Effect o f Camellianin A in Adinandra nitida Leaves and Its Apoptotic Induction in Human Hep G2 and MCF-7 Cells [J].Molecules，2010，15（6）：3878-3886.