周 朋，陶玉貴，曹 寧，張 健，劉任龍

（安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

脂肪酶又稱三酰甘油酯水解酶（EC3.1.1.3），可以專一高效地催化分解甘油三酯，普遍存在于動(dòng)植物和微生物中［1－3］.脂肪酶廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品和化妝品等行業(yè)［4－5］.相較于游離酶而言，固定化酶有著更好的操作穩(wěn)定性，有利于下游產(chǎn)物的分離純化，便于回收重復(fù)利用［6］.

目前，利用納米無機(jī)材料作為酶固定化的載體已得到廣泛應(yīng)用［7－8］.無機(jī)材料TiO2對(duì)有機(jī)物質(zhì)具有較好的吸附性，生物親和性好、無毒害，化學(xué)穩(wěn)定性好，機(jī)械強(qiáng)度高，將會(huì)是很好的酶固定化載體［9－10］.在酶的固定化中，酶與載體表面的作用方式可能會(huì)引起酶結(jié)構(gòu)的變異，增加底物與酶活中心的空間位阻，從而導(dǎo)致酶活力下降、酶固定量也受到限制.因而，研究酶蛋白在載體表面的界面特性是酶固定化的關(guān)鍵［11］.

本文在前期仿生合成納米TiO2基礎(chǔ)上，分別以仿生合成的納米線、納米花以及納米片TiO2為載體進(jìn)行脂肪酶固定化，進(jìn)一步研究固定化效果最好的載體.采用SEM、XRD、FT－IR以及比表面積分析儀等表征固定化酶，對(duì)納米TiO2載體固定脂肪酶的界面特性進(jìn)行了初步探究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

脂肪酶，牛血清蛋白，考馬斯亮藍(lán)，聚乙烯醇（PVP），無水乙醇，橄欖油，均為化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TiO2納米線（銳鈦礦，SBET＝312.58m2/g，Pore Radius Dv（r）＝16.69nm）、納米花（TiO2/ZnO復(fù)合體，SBET＝219.54m2/g，Pore Radius Dv（r）＝18.53nm）以及納米片（鈦酸鹽，SBET＝169.50m2/g，Pore Radius Dv（r）＝48.44nm）載體均為實(shí)驗(yàn)室自制.

1.2 酶固定化方法

在25mL濃度為0.1mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH＝7.5）中加入一定量的酶粉，攪拌0.5h使之充分溶解.然后將0.5g載體（靜置在pH＝7.0，濃度0.1mol/mL的磷酸緩沖溶液24h）加入脂肪酶的PBS中，室溫下攪拌一定時(shí)間，過濾，將固定化酶用濾液反覆洗滌，收集濾液，濾液待用，以便測定濾液中酶的活力.所得的固體干燥至恒重，得到固定化酶.

1.3 蛋白負(fù)載率和酶活測定方法

固定化酶蛋白含量的測定采用Brandford法.

固定化效率（% ）＝（初始酶液總蛋白－殘液總蛋白）/初始酶液總蛋白×100%.

固定化酶活力采用橄欖油乳化及NaOH滴定法測定.固定化酶活力單位：每克固定化酶在37℃下，每分鐘水解橄欖油產(chǎn)生1μmol脂肪酸所需的酶量為1個(gè)活力單位（U/g）.

1.4 表征方法

采用日立S－4800掃描電子顯微鏡研究樣品形貌；在Bruker D8Advance型X射線衍射儀上進(jìn)行XRD表征，采用連續(xù)掃描方式，掃描范圍2θ＝10°～80°；利用島津IRPrestige－21傅立葉變換紅外光譜儀研究樣品中基團(tuán)的變化；通過美國康塔NOVA 2000e比表面積及孔徑分析儀測試樣品的比表面積.

2 結(jié)果與討論

2.1 納米TiO2形貌對(duì)酶固載率的影響

分別以自制的線狀、花狀和片狀TiO2為載體，在相同條件下固定化脂肪酶，再測定固定化酶的活力和固載率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，3種載體中線型形貌載體的固載率最高，且酶活也較好.納米線型的TiO2為純的銳鈦礦，在3種載體中具有較高的BET、孔徑與脂肪酶也較為接近.因而，最終選擇固定化效果最好的線型形貌TiO2為載體，并研究了固定化時(shí)間、溫度、pH以及酶載量對(duì)固定化的影響.

2.2 納米線TiO2固載脂肪酶的條件研究

（1）加酶量對(duì)固定化的影響.在25mL、pH為7.5磷酸鹽緩沖液中分別加入0.1～1.6g的脂肪酶，于40℃下固定化6h，考察加酶量對(duì)固定化的影響，結(jié)果如圖2所示.由圖2可知，隨著酶量的增加，固定化的固載率和固定化酶活性都呈現(xiàn)出先增后降的趨勢.酶量達(dá)0.2g時(shí)，固載率和固定化酶活性均最高，此后再增加酶量，固載率和固定化酶活性呈現(xiàn)下降趨勢.這可能是由于加酶量為0.2g時(shí)，吸附到載體上的脂肪酶已達(dá)到飽和，難以繼續(xù)與反應(yīng)介質(zhì)中酶分子反應(yīng).因此，本實(shí)驗(yàn)采用0.2g作為最佳加酶量.

（2）pH對(duì)固定化的影響.在25mL、pH為6.0～8.5的磷酸鹽緩沖液中加入0.2g的脂肪酶，于40℃下固定化6h，考察了反應(yīng)體系pH值對(duì)固定化的影響，結(jié)果如圖3所示.由圖3可知，隨pH的升高，固定化的固載率和固定化酶活性都呈現(xiàn)先升后降.當(dāng)pH＝7.0時(shí)，固載率達(dá)到最高；而pH＝7.5時(shí)，固定化酶活性達(dá)到最高.綜合考慮選擇pH＝7.0為最適固定化pH.

圖1 不同載體對(duì)固定化的影響

圖2 加酶量對(duì)固定化的影響

圖3 pH對(duì)固定化的影響

（3）固定化時(shí)間對(duì)固定化的影響.在25mL、pH為7.5磷酸鹽緩沖液中分別加入0.2g的脂肪酶，于40℃下固定化1～9h，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)固定化的影響，結(jié)果如圖4所示.由圖4可知，隨著固定化時(shí)間的延長，固定化的固載率和固定化酶活性呈現(xiàn)增大的現(xiàn)象，但到一定條件后，固載率和酶活性的增加均趨向平緩.這可能是由于固定時(shí)間達(dá)到6h以后，TiO2載體的負(fù)載量也基本達(dá)到飽和，時(shí)間的延長，將不會(huì)增加酶的固載量.所以，固定化為6h已可以達(dá)到要求.

（4）固定化溫度對(duì)固定化的影響.在25mL、pH為7.5磷酸鹽緩沖液中分別加入0.2g的脂肪酶，于25～55℃下固定化6h，考察反應(yīng)溫度對(duì)固定化的影響，結(jié)果如圖5所示.由圖5可知，隨固定溫度的升高，固載率變化幅度較小，但對(duì)酶活性影響較大.在40℃時(shí)，固定化酶活性最高，隨溫度的升高酶活性迅速下降.原因是在高溫下，酶活性部位遭到破壞，從而導(dǎo)致酶活性下降.綜合考慮，以40℃為最佳的固載溫度.根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定pH、加酶量、吸附時(shí)間為影響脂肪酶固載率的3個(gè)顯著因素.采用Box－Beheken統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，對(duì)上述3個(gè)顯著因素進(jìn)行優(yōu)化，得到3個(gè)條件的最佳組合為：pH為7.0、加酶量為0.25g、反應(yīng)時(shí)間為6.3h，在此條件下，脂肪酶的理論固載率為80.12%.

2.3 納米線TiO2固載酶及其界面表征

（1）SEM分析.納米線TiO2固定前后的SEM圖如圖6所示.由圖6a可知，載體為形貌較好、線條分明的納米線，其直徑在20～40nm之間，長度達(dá)幾微米至十幾微米，納米線彼此交叉彎曲、相互交織.由圖6b可知，絮狀物是團(tuán)聚在納米線載體表面的脂肪酶.

圖4 固定化時(shí)間對(duì)固定化的影響

圖5 固定化溫度對(duì)固定化的影響

圖6 固定化前后樣品的SEM圖

（2）XRD分析.實(shí)驗(yàn)所用的納米線TiO2具有一定的介孔性質(zhì)，其孔徑為16.69nm，較接近于脂肪酶的三維尺寸.當(dāng)孔大小與蛋白質(zhì)尺寸相當(dāng)時(shí)，蛋白質(zhì)在孔內(nèi)的擴(kuò)散系數(shù)遠(yuǎn)高于在溶液中［12］.蛋白質(zhì)是否進(jìn)入載體材料的孔道內(nèi)，可根據(jù)XRD強(qiáng)度變化來判斷，一般載體吸附蛋白質(zhì)后XRD強(qiáng)度會(huì)下降［13］.納米線TiO2固定前后的XRD圖譜如圖7所示.對(duì)比可知，固定化前后的樣品均為無定形結(jié)構(gòu)，雖然很難判斷XRD衍射強(qiáng)度是否下降，但可明顯看出固定化前后兩者的XRD圖譜存在區(qū)別，一定程度證明了脂肪酶與載體納米線發(fā)生了作用.

（3）FT－IR分析.FT－IR對(duì)固載酶蛋白質(zhì)分子與載體的界面表征，結(jié)果如圖8所示.由圖8可知，游離脂肪酶（見圖8a）在1 651cm－1和1 533cm－1出現(xiàn)了紅外特征峰，分別屬于氨基I區(qū)和氨基II區(qū).其中氨基I區(qū)（1 600～1 700cm－1）來自于蛋白質(zhì)的ɑ－螺旋、β－折疊、β旋轉(zhuǎn)以及無規(guī)則卷曲.酰胺II區(qū)（1 500～1 600cm－1）為C－N伸縮振動(dòng)和蛋白質(zhì)骨架的N－H彎曲振動(dòng)［14］.對(duì)比可見，固定化酶（見圖8c）中也明顯含有這兩個(gè)特征吸收峰，從而證明游離的脂肪酶已固載于TiO2載體上，可能是由于脂肪酶在載體界面上二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，與文獻(xiàn)［15］報(bào)道一致.

（4）比表面積及孔徑分析.實(shí)驗(yàn)中所用納米線載體具有較高的比表面積，同時(shí)具有介孔性質(zhì).當(dāng)脂肪酶固定到納米線上，會(huì)引起納米線載體比表面積和孔徑上的改變.對(duì)固定化前后的樣品進(jìn)行N2吸附－脫附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖9和表1所示.由圖9可知，兩者均屬于Ⅴ型等溫線，且表現(xiàn)出一定的磁滯現(xiàn)象，但兩者存在明顯的區(qū)別.由表1可知，固定化酶的比表面積和平均孔徑均小于納米線載體，這說明脂肪酶結(jié)合到納米線載體的表面和空隙內(nèi).

圖7 固定化前后樣品的XRD圖譜

圖8 樣品的FT－IR圖譜

圖9 樣品的N2吸附－脫附等溫線

表1 樣品的比表面積及孔徑分析數(shù)據(jù)

3 結(jié)論

本文討論了3種不同形貌的TiO2為載體固定化脂肪酶，對(duì)固定化效果更好的納米線TiO2載體固定化脂肪酶做了進(jìn)一步研究.通過單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳條件，其中加酶量、pH、固定化時(shí)間的影響更為顯著.采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)加酶量、pH和固定化時(shí)間3個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)的組合為加酶量0.25g、pH 7.0、固定化時(shí)間6.3h.在此條件下，脂肪酶的理論固載率為80.12%.研究了納米二氧化鈦固定脂肪酶的界面特性.采用SEM、XRD、FT－IR以及比表面積分析儀等進(jìn)行表征，結(jié)果顯示，在納米線形貌的載體上存在脂肪酶的吸附.

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