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(湖南第一師范學(xué)院 體育系，湖南 長沙 410012)

高住低練對大鼠骨髓促紅細(xì)胞生成素受體蛋白表達(dá)的影響

曹蕾，鄭瀾，皮亦華

(湖南第一師范學(xué)院 體育系，湖南 長沙 410012)

研究目的：探討高住低練對大鼠骨髓細(xì)胞促紅細(xì)胞生成素受體(Erythropoietin receptor, EpoR)蛋白表達(dá)的不同作用。研究方法：本研究將健康雄性SD大鼠56只隨機(jī)分為7組，采用免疫組織化學(xué)及計(jì)算機(jī)顯微圖像分析，檢測EpoR在骨髓組織中的含量，分析運(yùn)動和低氧2種不同的處理因素對骨髓EpoR蛋白表達(dá)的效應(yīng)。研究結(jié)果：高住低練和低住低練都可使EpoR蛋白表達(dá)增加。高住低練中隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長，EpoR增加更明顯。結(jié)論：隨著低氧和訓(xùn)練因素的影響，EpoR蛋白有逐漸上升的趨勢，模擬高住低練能使EpoR蛋白表達(dá)加快。

高住低練；促紅細(xì)胞生成素受體蛋白；免疫組織化學(xué)

促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin, Epo)和促紅細(xì)胞生成素受體(Erythropoietin receptor, EpoR)與運(yùn)動訓(xùn)練關(guān)系的研究是從研究高原訓(xùn)練開始的。而在對高原訓(xùn)練的研究中發(fā)現(xiàn)在諸多影響運(yùn)動成績的因素里，缺氧對機(jī)體的刺激造成紅細(xì)胞和血紅蛋白的增加是最主要的因素。事實(shí)證明高住低練的訓(xùn)練模式與高原訓(xùn)練一樣也可以明顯地提高運(yùn)動員的成績[1]，而且由于低海拔高氧含量的訓(xùn)練可以上強(qiáng)度，高住低練的方法甚至優(yōu)于傳統(tǒng)的高原訓(xùn)練。許多研究認(rèn)為這是由于這種訓(xùn)練方法能通過身體缺氧刺激改變血漿Epo的量，Epo與其受體EpoR結(jié)合后發(fā)揮生物效力，使外周血中紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白含量升高，從而提高最大吸氧量，但近年來的對血漿中Epo的研究并未取得一致結(jié)果，因此，我們試圖通過探明EpoR蛋白表達(dá)的規(guī)律來證實(shí)高住低練與紅系細(xì)胞的關(guān)系，本研究就以高住低練的訓(xùn)練方式來研究在不同低氧時(shí)間和遞增運(yùn)動強(qiáng)度下EpoR蛋白表達(dá)的變化，進(jìn)一步明確EpoR在低氧訓(xùn)練中對紅系細(xì)胞生成的影響機(jī)制，為運(yùn)動實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

表1 本研究大鼠分組情況

健康雄性2.0月齡Sprague-Dawley大鼠56只，體重約200g(由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物學(xué)部提供)。用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料飼養(yǎng)，生活期間室溫保持20～23 ℃，相對濕度45～55%，每天光照12 h。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為7組，每組8只(表1)

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 訓(xùn)練方案

采用杭州立泰科技有限公司PT動物實(shí)驗(yàn)跑臺訓(xùn)練，共13天，每天一次，運(yùn)動強(qiáng)度依據(jù)Bedford所建立的運(yùn)動負(fù)荷模型[2]，訓(xùn)練時(shí)間為每晚18:00～22:00，詳細(xì)訓(xùn)練方案見表2。

表2 訓(xùn)練方案(速度×?xí)r間)

1.2.2 低氧安排

采用美國Hypoxico公司的低氧裝置，用美國產(chǎn)TOXIRAE PGM-36型氧氣監(jiān)測儀實(shí)時(shí)監(jiān)測低氧艙中氧含量的變化，并向低氧艙中充入純氮?dú)庖员３盅醴謮簽?1.3 kPa，每天訓(xùn)練后即刻置于低氧艙中6h[3-4]。

1.3 標(biāo)本制備

運(yùn)動訓(xùn)練方案結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)大鼠用25%烏拉坦1ml/100g體重麻醉，75%酒精浸泡消毒后取材。后將大鼠呈仰臥位固定于手術(shù)臺上，取雙側(cè)股骨切斷，取骨髓，涂于明膠處理的玻片上，4%多聚甲醛固定15 min，用0.01%PBS反復(fù)沖洗，置于4 ℃冰箱備用。

1.4 測試方法

1.4.1 免疫組織化學(xué)方法

免疫組化一抗由SANTACRUZE公司提供，所用工作濃度為1：200，SABC、DAB試劑盒及蘇木素由武漢博士德公司提供即用型。

1.4.2 計(jì)算機(jī)圖像分析

用美國Imager-pro圖像分析系統(tǒng)。EpoR的表達(dá)用陽性單位表示，公式為

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 鼠骨髓免疫組化及計(jì)算機(jī)圖像分析

2.1.1 免疫組化觀察結(jié)果

使用免疫組化ABC法對大鼠骨髓EpoR進(jìn)行標(biāo)記，EpoR定位于細(xì)胞膜上，呈圓球狀顆粒，彌散分布。對陽性單位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)在運(yùn)動時(shí)間和強(qiáng)度遞增，低氧時(shí)間延長的情況下EpoR的表達(dá)也隨之上升，但是運(yùn)動組即使是常氧運(yùn)動13天組，其表達(dá)的水平仍低于加了低氧因素的3天組。用肉眼觀察到的圖片也可以發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動低氧組的EpoR蛋白表達(dá)相比相同訓(xùn)練常氧組的要多(見圖1)：

圖1 骨髓細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色

A.未加一抗的陰性對照片。×40

B.對照組可見少量表達(dá)EpoR的細(xì)胞(棕色)?！?0

C.第2組訓(xùn)練低氧3天組，可見較多表達(dá)EpoR的細(xì)胞?！?0

D.第3組訓(xùn)練3天組?！?0

E.第4組訓(xùn)練低氧6天組?！?0

F.第5組訓(xùn)練6天組?！?0

G.第6組訓(xùn)練低氧13天組，可見許多表達(dá)EpoR的細(xì)胞。×40

H.第7組訓(xùn)練13天組。×40

2.1.2 計(jì)算機(jī)顯微圖像分析結(jié)果

表3列出了計(jì)算機(jī)顯微圖像分析得到的陽性單位灰度值。從圖2中可以看出，運(yùn)動和低氧與對照組相比較，低住低練組和高住低練組的EPOR蛋白表達(dá)都上升，但運(yùn)動3天組的相對對照組來說無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在運(yùn)動組的對比中，運(yùn)動3天、6天和13天組之間逐漸上升，差異具有顯著性；在高住低練的各組中，高住低練3天組與高住低練6天組之間EpoR蛋白表達(dá)的上升差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，運(yùn)動低氧13天組EpoR的表達(dá)與其它兩個(gè)低氧組相比顯著升高。高住低練組大鼠骨髓EpoR蛋白表達(dá)顯著高于低住低練組。

表3 EpoR蛋白表達(dá)免疫組化涂片計(jì)算機(jī)顯微圖像分析(陽性單位)

圖2 大鼠骨髓EpoR蛋白表達(dá)動態(tài)變化

3 分析與討論

EpoR是一種跨膜蛋白質(zhì)，62KD，由507個(gè)氨基酸組成，人與鼠有82%的同源性，其結(jié)構(gòu)可分為三部分：胞膜外部分，跨膜區(qū)域，胞內(nèi)區(qū)部分[6]。能表達(dá)EpoR的細(xì)胞主要為：紅系干細(xì)胞、巨核細(xì)胞的干細(xì)胞，另外多種神經(jīng)細(xì)胞亦可表達(dá)EpoR。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，Epo)的主要靶細(xì)胞就是紅細(xì)胞系集落形成細(xì)胞(CFU-E)，因而CFU-E具有促紅細(xì)胞生成素受體(EpoR)量最多。但其他一些細(xì)胞也有EpoR的存在如白血病細(xì)胞[9]。EpoR的數(shù)目與該細(xì)胞對Epo依賴性大小有關(guān)。有人證實(shí)，所有的CFU-E細(xì)胞上均有EpoR，而只有20%的FUE細(xì)胞上有EpoR。當(dāng)紅系細(xì)胞逐漸成熟，對Epo的依賴性下降，受體逐漸喪失，到成紅細(xì)胞階段只有很少的EpoR不再依賴Epo。

EpoR的表達(dá)受多種因素的影響，Grossi等進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)重組人紅細(xì)胞生成素(Recombinant Hunan Erythropoietin，rhEpo)能促進(jìn)紅白血病細(xì)胞EpoR的表達(dá)[8]。近年大量研究發(fā)現(xiàn)缺氧可以誘導(dǎo)大腦中EpoR mRNA表達(dá)。Spandou等的動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)持續(xù)結(jié)扎大鼠一側(cè)頸動脈，24 h后腦組織中EpoR mRNA表達(dá)顯著提高，提示在缺血缺氧條件下Epo/EpoR系統(tǒng)對神經(jīng)細(xì)胞起著重要的保護(hù)作用[9]。Sun等人的實(shí)驗(yàn)也支持這一觀點(diǎn)[10]。Yu X的動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在鼠胚胎腦神經(jīng)原中，缺氧能使EpoR表達(dá)增長10倍[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道缺氧是Epo產(chǎn)生的強(qiáng)有力刺激因子，也能刺激EpoR在組織中的表達(dá)[12]。還有研究證明在腫瘤中EpoR的表達(dá)與腫瘤的大小以及內(nèi)部的缺氧程度有關(guān)[13]，Ge RL在海拔1780米、2085米、2454米及2800米高度檢測安靜人群的腎臟供氧情況和血液中Epo的含量，發(fā)現(xiàn)進(jìn)入高原6小時(shí)后Epo就開始增加，同時(shí)尿的氧分壓呈下降趨勢。在較低的兩個(gè)高度(1780米和2085米)上，24小時(shí)后尿氧分壓回到了原來的值，但在其它兩個(gè)高度上則是持續(xù)降低，Epo在2454米的高度上則與尿氧分壓有相反的表現(xiàn)。證明了Epo上升的海拔高度為2100～2500米，人體在1780和2085米海拔經(jīng)過短期環(huán)境適應(yīng)之后就可以恢復(fù)腎組織的供氧，但在相對較高海拔卻可以引起持續(xù)的增長[14]。Beleslin- Cokic等發(fā)現(xiàn)Epo可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞EpoR的增殖和生成[15]。另外，HIF-1等因子也可以誘導(dǎo)EpoR的生成[16]。從而進(jìn)一步地驗(yàn)證了高原的缺氧環(huán)境對EpoR表達(dá)可能產(chǎn)生的影響。

國內(nèi)外有關(guān)運(yùn)動對骨髓EpoR蛋白表達(dá)的研究報(bào)道并不多見，有研究認(rèn)為運(yùn)動產(chǎn)生的熱量可使大鼠在顱腦損傷等應(yīng)激狀態(tài)下快速表達(dá)較多的EpoR[17]，說明運(yùn)動本身就可以提高EpoR的表達(dá)。以上所有這些研究都是在安靜狀態(tài)下進(jìn)行的。趙杰修等在運(yùn)動性貧血的研究中發(fā)現(xiàn)運(yùn)動性貧血大鼠骨髓中EpoR的mRNA表達(dá)顯著低于安靜對照組和運(yùn)動加營養(yǎng)組[18]。至今尚未見到有關(guān)低氧訓(xùn)練對骨髓EpoR蛋白生成的影響的報(bào)道。

本研究采用免疫組織化學(xué)及計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對EpoR蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示運(yùn)動和低氧都能夠使骨髓細(xì)胞EpoR蛋白表達(dá)逐漸增加，高住低練組大鼠骨髓細(xì)胞EpoR蛋白表達(dá)水平明顯高于低住不練組和低住低練組，表達(dá)的最高峰出現(xiàn)在低氧運(yùn)動13天組，說明高住低練能促進(jìn)大鼠骨髓細(xì)胞EpoR蛋白的表達(dá)，并且隨著運(yùn)動和低氧時(shí)間的延長對EpoR蛋白表達(dá)有累積作用。在運(yùn)動訓(xùn)練3天組與安靜對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能說明3天的運(yùn)動訓(xùn)練不能影響骨髓細(xì)胞EpoR蛋白表達(dá)。這是否意味著低氧訓(xùn)練可以使EpoR蛋白表達(dá)的增加提前出現(xiàn)，并且出現(xiàn)更高的峰值；在峰值出現(xiàn)之后是否會出現(xiàn)下降或維持特定水平，還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

4．1 骨髓EpoR蛋白表達(dá)隨著低氧和訓(xùn)練因素的影響，EpoR蛋白表達(dá)有逐漸上升的趨勢，模擬高住低練能使EpoR蛋白表達(dá)加快。

4．2 模擬高住低練實(shí)驗(yàn)13天的實(shí)驗(yàn)中，EpoR蛋白表達(dá)隨時(shí)間延長而得到積累，在實(shí)驗(yàn)中沒有峰值的出現(xiàn)。

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Influence of living high and training low on erythropoietin receptor of rat bone marrow

CAO Lei, ZHENG Lan, PI Yi-hua

(1.College of Physical Education, Human Normal University, Changsha 410012, Hunan,China;2. Hunan Institute of Sport Science, Changsha, China)

Objective:To explore the effect of different training pattern and hypoxic stimulus on protein expression of hypoxia induced erythropoietin receptor on bone marrow.Methods:56 male SD rats were randomly divided into 7 groups. Immunohistochemical technology and computer image processing method were applied to exam the content of erythropoietin receptor on bone marrow, and the effect of hypoxia and training on rat bone marrow erythropoietin receptor were analyzed.Results:Erythropoietin of bone marrow was increased in both high-altitude living but low-altitude training group and low-altitude living and low-altitude training group.With the extending of training time, the increase of erythropoietin receptor was obvious.Conclusion:Living-high training-low could increase the protein expression of erythropoietin receptor.

living-high training-low; erythropoietin receptor; immunohistochemistry; bone marrow

2014-02-25

曹蕾(1980- )，女，湖南人，講師，碩士，研究方向運(yùn)動人體科學(xué)。

A

1009-9840(2014)06-0072-04