孔研 曲范杰

在我國, 胃癌屬于常見的惡性腫瘤, 病發(fā)率高居第三。胃癌的治療措施有限, 大多的胃癌治療藥物具有很高的耐藥性, 導(dǎo)致其療效有限［1］。當(dāng)今, 分子生物技術(shù)的發(fā)展, 基因治療已成為可能, 對于胃癌的治療具有廣闊的前景［2］?，F(xiàn)將其與化療藥物表阿霉素聯(lián)合使用, 探討兩藥合用時(shí)對胃癌細(xì)胞的抑制作用, 具體情況如下。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 ①重組人p53腺病毒(深圳賽百諾基因技術(shù)有限公司, 國藥準(zhǔn)字S20040004)；②表阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司, 國藥準(zhǔn)字H20030674)；③RPMI-1640細(xì)胞組織培養(yǎng)液(Hyclone, USA)；④標(biāo)準(zhǔn)新生的牛血清；⑤PI試劑盒；⑥購自Santa公司的兔抗p53抗體；⑦DPA、SP試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司提供)。上述藥物與試劑均在有效期內(nèi)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞(MGC-803)由本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存, 胃癌細(xì)胞在含有10%的新生標(biāo)準(zhǔn)牛血清的RPMI-1640細(xì)胞組織培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng), 恒溫37℃、5%CO2、在適度飽和的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)［3］。

1.3 細(xì)胞增殖曲線 胃癌細(xì)胞以45000/孔的量接種在24孔的細(xì)胞培養(yǎng)板上, 相應(yīng)得分為實(shí)驗(yàn)組與對照組, 實(shí)驗(yàn)組對應(yīng)的孔徑內(nèi)分別注入109vp的rAd-p53、10-6g EPI, 兩藥合用(109vp+10-6g EPI), 并加入培養(yǎng)液1 ml/孔, 每組設(shè)有3個(gè)復(fù)孔；對照組的孔徑中僅加入1ml的細(xì)胞培養(yǎng)液, 進(jìn)行常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)。次日, 使用胰酶/EDTA進(jìn)行消化并收集, 技術(shù)每組計(jì)數(shù)需重復(fù)3次, 堅(jiān)持6 d, 根據(jù)數(shù)據(jù)繪制相應(yīng)的細(xì)胞增殖曲線［4］。

1.4 流式細(xì)胞分析 胃癌細(xì)胞以500000/孔的量接種在6孔的細(xì)胞培養(yǎng)板上, 相應(yīng)得分為實(shí)驗(yàn)組與對照組, 實(shí)驗(yàn)組對應(yīng)的孔徑內(nèi)分別注入5×109vp的rAd-p53、10-6g EPI, 兩藥合用(5×109vp+10-6g EPI), 并加入培養(yǎng)液3 ml/孔；對照組的孔徑中僅加入3 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液。經(jīng)過72 h培養(yǎng)后, 使用胰酶/EDTA進(jìn)行消化并收集, 離心, PBS清洗, 使用PI試劑盒染色后, 通過流式細(xì)胞分析儀FC500觀察細(xì)胞的周期及凋亡情況［4］。

1.5 細(xì)胞形態(tài)的觀察 胃癌細(xì)胞接種于無菌培養(yǎng)板中, 放置無菌蓋玻片, 分別加藥培養(yǎng), 72 h后取出, 使用PBS清洗,運(yùn)用甲醇固定30 min, 染色, 觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.6 細(xì)胞的免疫化染色 重復(fù)1.5步驟, 固定細(xì)胞后, 使用0.3%TritonX-100 于37℃下孵育30 min, 使用PBS清洗, 染色,觀察p53基因蛋白的表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖曲線的比較 EPI組在用藥的1、2、3 d以及6 d后, 對胃癌細(xì)胞的抑制百分率分別為60.68%、66.89%、74.31%、94.13%；rAd-p53組的抑制百分率分別為：35.49%、45.56%、58.56%、79.34%；兩藥聯(lián)合組的抑制百分率為：59.93%、67.05%、68.65%、99.40%, 兩藥聯(lián)合運(yùn)用的抑制率與單藥處理的抑制率相比, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 細(xì)胞的周期及凋亡的比較 與對照組進(jìn)行比較, 可得EPI與rAd-p53均可影響細(xì)胞的分裂周期；重組人p53腺病毒主要使胃癌細(xì)胞停留于G2/M期, 聯(lián)合EPI對細(xì)胞G2/M期的阻滯作用, 使Sub-G1的凋亡峰極高。

2.3 細(xì)胞形態(tài)的觀察 對照組中, 細(xì)胞呈現(xiàn)圓形, 大片得聚集生長, 細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；EPI組的細(xì)胞呈現(xiàn)小片地聚集狀,結(jié)構(gòu)和形態(tài)較為完整；rAd-p53組則只有少量聚集, 并且細(xì)胞形態(tài)破壞, 無規(guī)則形態(tài), 細(xì)胞凋亡。兩藥聯(lián)合組的細(xì)胞數(shù)急劇減少, 形態(tài)結(jié)構(gòu)完全破壞, 細(xì)胞質(zhì)染色較深, 凋亡數(shù)目比rAd-p53組明顯增多。

2.4 p53基因蛋白的表達(dá) 對細(xì)胞進(jìn)行免疫化學(xué)染色可得,rAd-p53組與兩藥聯(lián)合組的細(xì)胞核以及細(xì)胞質(zhì)之中均有p53蛋白的表達(dá), 兩藥聯(lián)用組的p53基因蛋白的表達(dá)更明顯；而對照組與EPI組中, p53蛋白只于細(xì)胞核中表達(dá)。

3 討論

rAd-p53屬于基因治療藥物, 以腺病毒為載體, 可以在胃癌細(xì)胞及細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)p53抑癌基因, 啟動(dòng)凋亡程序。本研究發(fā)現(xiàn), rAd-p53對胃癌細(xì)胞增長的抑制有顯著療效。在給藥1、2、3 d、以及6 d后, rAd-p53組的抑制百分率分別為：35.49%、45.56%、58.56%、79.34%。但在給藥后第6天, 胃癌細(xì)胞的生長又有小幅度的上升, 說明rAd-p53不能把野生型p53整合至胃癌細(xì)胞的基因組, 僅能將其作為外源性基因的短時(shí)表達(dá), 提示在臨床用藥時(shí)需多次給藥。

EPI屬于蒽環(huán)類藥物, 其作用機(jī)制是直接與DNA堿基形成復(fù)合物, 阻止mRNA的合成, 從而抑制細(xì)胞的有絲分裂。因此, EPI組在給藥后1 d就出現(xiàn)了抑制作用, 且抑制作用相對較高, 在給藥1、2、3 d以及6 d后, EPI組的抑制效率分別為60.68%、66.89%、74.31%、94.13%。

通過本研究可以發(fā)現(xiàn)將rAd-p53與EPI聯(lián)用時(shí), 有協(xié)同作用, 有助于提高治療胃癌的療效。

［1］劉寧, 婁金麗, 李寧.P53基因治療腫瘤的研究進(jìn)展.北京醫(yī)學(xué),2010, 32(9):751-753.

［2］陳光俠, 鄭麗紅, 劉世育, 等.重組人P53腺病毒聯(lián)合奧沙利鉑對胃癌細(xì)胞BGC-823的生長抑制作用.江蘇醫(yī)藥, 2012,33(5):551-554.

［3］黃波, 司永峰, 蘭桂萍, 等.rAd-p53瘤內(nèi)注射前后鼻咽癌原發(fā)灶p53、p21WAFI蛋白的表達(dá)及意義.廣西醫(yī)學(xué), 2011, 23(11):1397-1400.

［4］劉月明, 王晚萍, 周云.重組人p53腺病毒感染對攜帶不同p53狀態(tài)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2012, 21(8):740-742.

［5］張燕華, 謝憶山, 劉少平, 等.重組人p53腺病毒聯(lián)合表阿霉素抑制胃癌細(xì)胞的體外研究.中國腫瘤臨床, 2010, 37(18):1024-1027.